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élevé, il fallait opérer différemment suivant les souches et suivant les phages. Cependant, on peut obtenir des Iysats ayant un bon titre avec des proportions assez variables de phages et de germes. Pour déterminer les conditions optima, nous avons fait des essais systématiques et nous avons pu ainsi adopter une technique un peu différente pour chaque phage et chaque souche. A titre d'exemple, nous allons citer notre expérience faite avec le phage D 4 sur la souche I. ;
Nous avons opéré sur 10 cm* de notre milieu (voir chapitre IT) contenu dans les ballons Kjeldahl; nous avons ensemencé largement en faisant directement, dans le milieu, une suspension de germes à partir d’une culture sur gélose inclinée ayant dix-huit heures d’étuve. Après une demiheure au bain-marie à agitation à 37°, on inocule le phage. Après cinq heures environ, la lyse est rarement totale, mais le milieu s’est éclairci et les débris de germes forment des agglutinats au sein du liquide, c’est à ce moment là que l’on effectue le titrage.
N°" GERMES PHAGES TITRE DES BALLONS PAR CM° PAR CM° PAR CM* 1 800 millions 500.000 84 X 105 2 — — 5.000 L8 X 10!
3 400° , — 500.000 FSC TON 4 — — 5.000 4,8 X 10° 5 200. — 500.000 DAC 10 6 — — 9.000 2,1:0C 10%
Pour obtenir le phage D 4/1, nous ensemençons donc en effectuant, au sein du milieu, une suspension à 400 millions de germes par em* et, après demi-heure au bain-marie à agitation, nous inoculons le phage dans la proportion de 5.000 par cm*.
Le phage D 4/II est préparé dans les mêmes conditions
en ensemençant le milieu avec 400 millions de germes de la souche IT par em, et en inoculant le phage après une demiheure, à raison de 10.000 par em.
Le phage D 5/I est préparé en SR TA le milieu avec 200 millions de germés de la souche I et en inoculant, après une demi-heure, le phage à raison de 100.000 par cm*.
Le phage D 5/II est préparé en ensemençant le milieu avec 200 millions de germes de la souche I par em, et en inoculant 50.000 phages par em° après une demi-heure.
Le phage T 5/1 est préparé avec la souche I ensemencée à raison de 200 millions par em’, et on inocule, après une demi-heure, 100.000 phages par em*.
Les phages T 5/II et T 5/0 sont préparés dans un Hart ensemencé avec 200 millions de germes par cm°, dans lequel on inocule, après une demi-heure, 50.000 phages par cm.
Ces deux derniers phages donnent, sur leurs souches respectives, un mélange à peu près égal de grandes et de petites plages. Nous avons récupéré séparément ces deux sortes de plages et nous avons constaté que nous avions affaire à un mélange de deux phages; le phage à grandes plages à toujours donné des grandes plages, et le phage : petites plages toujours des petites plages. Toutes les expériences ont été faites avec ce mélange.
Les phages D 5 A/I et D 5 A/II sont préparés en ensemençant le milieu avec 200 millions de germes, et le phage est inoculé après une demi-heure, à raison de 20.000 par cm. Nous voyons par ce qui précède que les conditions de préparations des lysats sont variables selon les phages et les souches; nous avons indiqué les proportions et les conditions approximatives, celles-ci sont en effet assez variables, et nous avons souvent obtenu des lysats de même titre préparés dans des conditions différentes. Le titre de nos différents phages est toujours supérieur à 10° par cm°, et peut être beaucoup plus élevé pour certains d’entre eux le D 4/1, par exemple, qui peut atteindre 10°.
OR
CLARIFICATION DES LYSATS
Le plus souvent, nous préparons 100 cm* de lysat de chaque phage pour en avoir un stock important. Ces Iysats doivent être clairs, stériles et de conservation facile, Nous avons, dans ce but, adopté un traitement standard que nous leur faisons subir. Après la lyse, nous faisons un premier titrage pour voir si nous ne perdons pas de phages par la suite; ce titrage est effectué après une première centrifugation de dix minutes pour débarrasser le lysat de la plus grande partie des germes et débris microbiens. Mais la centrifugation ne ‘suffit pas à clarifier les lysats, et nous y ajoutons l’adsorption des impuretés sur phosphate de calcium, d’après la technique de R. WaxL et L. BLUM- EMERIQUE [25 et 26], avec certaines modifications.
Le lysat est alcalinisé à pH 7,8 avec 0,50 g. p. 100 de CO;Na, cristallisé environ. Après dissolution, on forme un précipité de phosphate de calcium par addition de 10 cm* p. 100 de solution stérile de CaCL à 4 p. 100; après quinze minutes de repos à la glacière, on centrifuge cinq minutes. On obtient ainsi un lysat très clair mais non stérile.
