CHAPITRE Ill

Etude de la composition du milieu pour la production optima du phage D 4 sur S. Danysz

Nous sommes partis d’un milieu synthétique de base de composition connue (R. WaAHL et L. BLUM-EMERIQUE [31]), et constitué par un mélange de trois solutions. La première est ainsi composée :

Chlorure de potassium 52207 700" 0,50 £g.

Sultate d'AMMONMIUME AA TETE 0,75 g.

Sulfate de’magnésitimn 45752. 0.000 0,05 g.

Acide niCOURIQUE LR MAMAN 0,01 g.

Eau bidistiléé 25 eee q. ss. p. 100 cm.

À cette première solution on ajoute 7,5 cm* pour 100 cm° d’une solution de glucose à 30 p. 100 stérilisée à part.

On ajoute ensuite 10 cm d’une solution de phosphate, tamponnée à pH 7,6, de formule :

Phosphate disodique, 12H°0.. R.P..... 19956.

Phosphate monopotassique .. Merck... 0,45 g.

Eau hidistillée in RES RES Eee 100 cm:

Dans le milieu synthétique ainsi préparé, notre germe pousse très bien. Nos essais sont pratiqués sur 10 cm* de ce milieu auquel on ajoute III gouttes de solution de CaCL à 0,4 p. 100 correspondant à la concentration optima d’ion calcium pour la multiplication de nos phages. R. WaHL [24, 28] a montré, en effet, qu’il existe pour chaque phage une concentration optima de cet ion.

AR rare

Nous avons cherché à compléter ce milieu de base pour lé rendre plus favorable à la multiplication de nos phages.

En pratiquant des passages en bouillon, eau peptonée et milieu à lhydrolysat de caséine (préparation de GLADSTONE et FiLDES [8]) auxquels nous ajoutons VI gouttes de glucose à 30 p. 100 et IIT gouttes de CaCL à 0,4 p. 100 pour 100 em’, nous obtenons approximativement le même titre dans les trois cas. Des passages comparatifs en milieu à l’hydrolysat de caséine et en milieu synthétique nous ont montré que ce dernier n’est pas assez riche pour un rendement optimum en phages. Les différences sont de l’ordre suivant :

Rae \ milieu à lhydrolysat ...... 18710?

x | milieu synthétique ........ Vo FI0Se . , | milieu à l’hydrolysat ...... 3,6 X 10° AT CSSALI RE ne à He Due milieu synthétique ........ 1,8 X 105

D’après ce premier résultat, nous avons introduit dans notre milieu synthétique de base des hydrolysats de caséine préparés selon la technique de GLADSTONE et FILDES.

On prépare la solution suivante dont on introduit des quantités variées :

ÉDydrolysatitevpsiquet er.) 3 CM° HIVOEORVSA DE TCIAE SR EAN, 7 7,5 cm° LD Dre TR DS SLI LS CRE RNA PARA ES 180 cm:

Nous avons déterminé qu’il suffit de XX gouttes de cette solution pour 10 cm° de milieu synthétique, pour obtenir un bon rendement.

Des expériences comparatives faites avec le mélange des deux hydrolysats et l'hydrolysat acide seul nous ont prouvé que ce dernier contenait tous les éléments nécessaires à la croissance du phage, Phydrolysat trypsique n’ayant aucune action améliorante. Nous avons donc finalement utilisé l’'hydrolysat acide seul à la concentration indiquée ci-dessus.

Les conditions dans lesquelles ont été faites les experiences qui vont suivre sont celles-ci : 10 em° de milieu

Pre d'A

sont ensemencés avec VIIL gouttes d’une suspension de germes contenant 200 millions par cm. Les expériences sont faites dans des petits ballons Kjeldahl qui sont placés au bain-marie à agitation à 37° pendant une heure quinze; à ce moment, on inocule dans chacun la même quantité de phage, soit III gouttes d’une dilution à 107? d’un phage titrant 50 plages à 107‘. Nous pratiquons les titrages cinq heures après.

Dans cés conditions expérimentales, nous avons pratiqué deux séries d’essais

1° Au milieu contenant de lhydrolysat de caseéine, nous avons ajouté des substances qui auraient {a possibilité d'augmenter le rendement en phages. Ces éléments sont les suivants :

Le tryptophane, qui est absent de l’hydrolysat; nous l'avons employé en solution M/40, de même la glutamine en solution à 0,50 g. p. 1.000. Les ions Fe et Mn entrant souvent dans les divers processus enzymatiques, nous avons fait une solution de (SO,).Fe, à 1 p. 1.000 et de CLMn à 1 p. 1.000. Nous avons, de plus, essayé l’eau de levure conservée sous CHCI, qui est très riche en vitamines. (Préparation d’après GLADSTONE et FILDES [8].)

Expérience Tube n° 1 milieu synthétique.

— 2 — —— + XX gouttes hydrolysat.

—. 8 — — + XX — — RATE — tryptophane.

— À — > + X — eau de levure.

— 9 — — + III — glutamine.

-.. 6 — — Ho ee CEMR:

"7 — + MS (SOL) Fe Résultats :

TUbDE no ET ARR ERREUR RE Lee Qu A La — PP ANT DEN DE 5 Pan. Li €

DA DORA MAN ie al: À 1,5 X 105 = AN RE Du tie 15 @10° La D 15 X 105 = 7e ONE 1,5 X 105

Cette expérience a été faite deux fois en donnant des résultats analogues. Il en ressort que la présence de l’eau de levure paraît diminuer le rendement, le rôle des ions Fe et Mn, ainsi que celui de la glutamine sont nuls. Quant à lhydrolysat, il augmente considérablement le rendement en phages par rapport au milieu synthétique seul, même quand on n’en ajoute qu’une petite quantité qui est ici de l’ordre de XX gouttes pour 10 em. Le rôle favorable du tryptophane se montre d’une façon indéniable.

Nous avons établi la composition du milieu que nous employons d’après les résultats de ces expériences.

2° Dans une deuxième série d’essais, nous avons cherché à remplacer l’hydrolysat de caséine par une solution contenant un ou plusieurs aminoacides. Nous avons fait avec chacun de ceux que nous avions à notre disposition une solution M/20 et nous les avons répartis en trois groupes après mélange de toutes les solutions à parties égales.

1 2 3 Asparagine Tyrosine Méthionine Glycocolle Phénylalanine Ornithine Alanine Tryptophane Cystéine Leucine Proline

7 Isoleucine Hydroxyproline Sérine Histidine Thréonine

Expérience

Tube n° 1 milieu synthétique + XV gouttes de 1 NE — + XV. — : de2 —. 3 — — a XV, de 3

Lo + X gouttes de 1

Tube n° 4 milieu synthétique HOPKINS der2 EN RM eee be CI RUES SEA | + XX gouttes hydrolysat Tube n° 5 milieu synthétique | Tr io bitee Résultats :

UD TERME RAT HONTE 7,5 X 10° — PARRALLR RE RS NT ISERE 6 X 10“ — SPORE Se AE 62x10 — AC NPD D da 2,4 X 10° Ne PV E Ne RS ETC 6210

L’'hydrolysat n’est pas remplaçable par les quelques amino-acides que nous avons utilisés. L'action améliorante du tryptophane est elle-même masquée dans le mélange n° 2, celle-ci ne se manifeste qu’en présence d’hydrolysat. Un grand nombre d’amino-acides doit être nécessaire au phage (comme le laissent supposer les résultats du tube n° 4) auxquels doivent s'ajouter peut-être des facteurs mal connus contenus dans l’hydrolysat.

Les résultats précédents nous ont permis d'adopter des . phages préparés dans le milieu synthétique dont nous avons indiqué la formule, auquel nous avons ajouté 20 p. 100 de la solution d’hydrolysat acide de caséine (7,5 cm’ d’hydrolysat pour 180 cm*° d’eau bidistillée) et 3 cm° p. 100 d’une solution de tryptophane M/40.