MILIEUX NUTRITIFS

Les microbes qu’on rencontre dans les eaux présentent souvent un pléomorphisme très étendu et une sensibilité parfois très grande à des variations en apparence insignifiantes dans' la composition des milieux nutritifs. Pour faire des observations réellement utiles, il est donc indispensable d’adopter des types invariables de milieux nutritifs, préparés toujours de la même façon et renouvelés aussi souvent que possible.

En raison de Limportance qu’on doit attacher à la composition et à la bonne préparation des milieux nutritifs à utiliser, il y a lieu d’indiquer les meilleures formules à employer, avec description de leur mode d’obtention.

Les milieux à utiliser pour mener à bien une analyse microbiologique d’eau sont les suivants : bouillon nu-

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tritif ordinaire; 2° bouillon phéniqué ; 3^ bouillon lactosé carbonaté ; 4° solution depeptone ; 5° gélatine nutritive; 6° gélatine-gélose ; gélose nutritive ; 8° gélatine et gélose colorées par tournesol ; 9° pommes de terre ; 10° milieu d’Elsner.

1° Bouillon nutritif :

Viande de bœuf 600 grammes

Eau distillée i litre

Peptone fraîche 10 grammes

Sel marin ; 5 —

Hydrate de soude q. s.

Faire macérer pendant une heure au moins, dans une capsule de porcelaine très propre, 500 grammes de viande de bœuf de première qualité, hachée en menus morceaux, dans 1 litre d’eau distillée. — Exprimer. — Porter lentement à l’ébullition en chauffant sur une double toile métallique et en agitant constamment pour empêcher l’albumine coagulée de prendre au fond et de produire une surchauffe. Maintenir à l’ébullition pendant quelques minutes. Filtrer sur un filtre préalablement mouillé pour retenir les graisses. Ajoutez 10 grammes de peptone fraîche et 5 grammes de sel marin. Alcaliniser légèrement pour saturer l’acide sarcolactique normal de la viande, et toujours de la même façon, car les microbes sont très sensibles aux plus légers changements dans la réaction des milieux. Chauffer à l’autoclave à 115° pendant un quart d’heure. A cette température, les phosphates terreux sont à peu près complètement précipités, surtout en milieu alcalin, et déposent rarement ensuite. Répartir dans de petits ballons ou tubes à essais préalablement stérilisés à raison de 10 cen-

d64 EAUX POTAlîLES ET MINÉRALES

timètres cubes par tube, en se servant d’un entonnoir à longue douille pour éviter que les parois extérieures du tube en contact avec le coton ne soient touchées par le bouillon. On bouche à l’ouate, on stérilise de nouveau, mais cette fois à 110° pendant vingt minutes, c’est-àdire à une température un peu au-dessous de la première pour éviter l’apparition d’un nouveau trouble phosphatique. On flambe, on recouvre d’un capuchon de caoutchouc stérilisé pour éviter oxydation et évaporation, et l’on conserve à l’abri de la lumière.

Un bouillon bien préparé doit être limpide et stérile ; et les tubes obtenus laissés plusieurs jours à l’étuve, à 37®, ne doivent pas se troubler.

Le chauffage à 115® stérilise très bien ; mais il ne faut pas perdre de vue qu’il amène un commencement de décomposition des matières organiques, qui fonce le bouillon, surtout l’alcalin, et qui peut aller jusqu’à dégagement d’ammoniaque et de produits pyrogénés plus ou moins antiseptiques qui abaissent son pouvoir nutritif. Aussi, dans quelques laboratoires, pour éviter ces altérations, on le prépare toujours à l’autoclave, mais à 100® seulement ; c’est-à-dire à robinet ouvert; et on arrive à le stériliser par chauffage discontinu, en répétant la même opération plusieurs jours de suite. Dans ce cas, les tubes et les ballons de culture qui sont destinés à le recevoir doivent être préalablement stérilisés à fond et autant que possible par la chaleur sèche entre 150 et 1,60®.

La composition intime des bouillons ainsi obtenus n’étant pas exactement connue, il est très difficile de déterminer avec précision la nature des modifications qu’y apportent les microbes qu’on y introduit ; mais en pratique, ce milieu est très favorable à la culture des

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aérobies et anaérobies facultatifs de l’eau, et se prête mieux que tout autre à l’étude des réactions microbiologiques qu’on peut avoir à pratiquer ; et de plus il est indispensable pour l’obtention des cultures destinées à l’expérimentation physiologique.

2® Bouillon phéniqué. — Le bouillon phéniqué à adopter est le bouillon ordinaire ci-dessus, additionné de 2 grammes d’acide phéniqué neigeux cristallisé pur pour 1 litre de bouillon. On le répartit ensuite en petits ballons Pasteur ou flacons coniques d’Erlinmayer bien stérilisés à raison de 20 centimètres cubes par ballon.

Dans les ensemencements en masse, indispensables pour la recherche des bacilles suspects ; chaque ballon additionné de 20 centimètres cubes de l’eau, donnera un liquide nutritif phéniqué au millième.

3*^ Bouillon lactosé carbonaté. — Se prépare en ajoutant par tube de bouillon de 10 centimètres cubes, X à XX gouttes d’une solution aqueuse saturée, stérisée de lactose, puis quelques gouttes de suspension épaisse de carbonate de chaux dans de l’eau distillée préalablement stérilisée. Si l’on avait des doutes sur la pureté du liquide ainsi obtenu, il faudrait de nouveau stériliser le tout à l’autoclave.

4® Solution de peptone. — Cette solution indispensable pour obtenir la réaction de l’indol avec le Bacterium coli et la réaction indol-nitreuse avec le vibrion cholérique, se prépare en dissolvant 2 grammes de peptone dans 100 centimètres cubes d’eau distillée, et en stérilisant le tout à l’autoclave.

La peptone employée doit être bien exempte de sucre;

et, avant de l’adopter, il est bon de l’essayer préalablement avec un coli-bacille parfaitement authentique.

5"" Gélatine nutritive :

Viande de bœuf..

Eau distillée

Peptone fraîche . .

Sel marin

Gélatine blanche.

Hydrate de soude

... . . oOO grammes

1 litre

10 grammes

Faire macérer pendant une heure au moins dans une capsule de porcelaine très propre, 500 grammes de viande de bœuf, hachée en menus morceaux, dans un litre d’eau distillée. Exprimer. Ajouter peptone 10 grammes, sel marin 5 grammes et gélatine 110 à 120 grammes, selon la saison. Chauffer au bain-marie pour dissoudre la gélatine, mais sans dépasser la température de 60% de façon à ne. pas coaguler tout d’abord la totalité des matières albuminoïdes dont on aura besoin plus tard pour la clarification. Comme la gélatine est acide, et qu’elle ajoute son acidité à celle de la viande, il ne faut neutraliser par l’hydrate de soude qu’après sa dissolution complète. On peut même alcaliniser très légèrement, car une légère alcalinisation convient parfaitement à la plupart des microbes pathogènes, et débarrasse la gélatine des phosphates terreux qui, en se précipitant par la suite, troubleraient le milieu ; mais il ne faut pas perdre de vue qu’un excès de soude atténuerait les propriétés gélifiantes de la gélatine. Après cette opération, la gélatine sera portée au bain de vapeur de l’autoclave à 100% robinet ouvert pendant une heure. La température ne devra jamais dépasser 105°, car au-dessus, en milieu alcalin, les propriétés gélifiantes de la gélatine seraient

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détruites. On pourra également employer pour sa stérilisation, le chauffage discontinu. A la température de lOO^", la coagulation des matières albuminoïdes est suffisante pour entraîner les phosphates terreux précipités et former un chapeau de matières coagulées, recevant un liquide clair. Cependant, si la coagulation n’était pas complète, on ajouterait un supplément d’albumine emprunté au blanc d’œuf, de façon à obtenir un collage plus complet, et par suite une clarification irréprochable.

- On filtrera rapidement à chaud au papier Chardin, à gros grains, dans un entonnoir à filtration chaude, et on recevra dans des tubes préalablement stérilisés, sans souiller le haut des tubes touché par le coton de fermeture. Les tubes ordinaires employés en bactériologie, ayant généralement 16 centimètres de haut sur 1 centimètre et demi de large; nous conseillons de faire deux sortes de tubes : les uns contenant 5 centimètres cubes de gélatine en hauteur, destinés à recevoir les colonies isolées ; et les autres remplis à 10 centimètres, qu’on réservera pour la préparation des boîtes de Pétri employées à la numération et à l’isolement des colonies.

En dehors des tubes droits, on peut aussi en préparer d’inclinés.

C’est Koch qui, le premier, a introduit la gélatine nutritive en bactériologie; et depuis ce moment la culture et la séparation des microbes aérobies de l’eau est devenue vraiment facile et commode à suivre en raison de la transparence du milieu. Comme la gélatine fond à 24-25®, et qu’à 30® elle est très fluide, on peut l’ensemencer à cette température avec l’eau à examiner sans avoir à craindre la destruction par la chaleur de certains microbes fragiles qui peuvent y être contenus. En redevenant solide, elle emprisonnera les microbes

qu’on y aura incorporés, et qui seront obligés de pousser en colonies, là où ils se trouvaient au moment de la solidification.

La gélatine qui réunit la plupart des avantages des milieux liquides et solides, gélifie environ dix fois son poids d’eau. Par contre elle a un inconvénient majeur : elle fond vers 25° en devenant un mauvais bouillon.

Malgré ces quelques inconvénients, la gélatine nutritive a rendu et rend tous les jours de grands services dans l’analyse microbienne des eaux.

6° Gélatine-gélose. — Dans la préparation de la gélatine nutritive ci-dessus, on peut incorporer assez facilement 1/2 0/0 de gélose : ce qui permet d’obtenir un milieu encore transparent et pouvant supporter sans fondre les températures de 33-37° entre lesquelles se développent bien la plupart des bactéries pathogènes.

Ce milieu mixte peut aussi rendre des services en été et dans les pays chauds : et en général partout où l’on ne possède pas d’étuve refroidissante pour l’emploi delà gélatine pendant les chaleurs.

Les microbes liquéfiants arrivent quand même à liquéfier la gélatine, mais plus lentement.

7° Gélose nutritive :

Viande de bœuf 500 grammes

Eau distillée 1 litre

Peptone fraîche 10 grammes

Sel marin 5 —

Gélose (agar-agar) 15 —

Faire macérer pendant une heure au moins, dans une capsule de porcelaine très propre, 500 grammes de viande de bœuf, hachée dans 1 litre d’eau distillée.

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ExprirTiGr. Ajouter 10 grammes depeptone eto grammes de sel marin. Portera l’ébullition et filtrer. Alcaliniser légèrement avec de la soude et ajouter 15 grammes de gélose coupée en morceaux. Il faut toujours alcaliniser avant de chauffer ; car à haute température en milieu acide, la gélose se transforme en sucre soluble, capable de réduire la liqueur de Fêhling, et perd en même temps son pouvoir gélifiant. On chauffe alors à l’ébullition en agitant jusqu’à ce que les parties solubles de la gélose soient dissoutes. On passe au tamis. On laisse refroidir au-dessous de 60°. On ajoute un blanc d’œuf délayé dans 100 grammes d'eau distillée. On mélange bien le tout. On chauffe à 115° pendant trois quarts d’heure au moins. On filtre sur papier Chardin dans un entonnoir à filtration chaude, et on répartit dans des vases de culture ou des tubes à essais, autant que possible stérilisés à l’avance. On restérilisera le tout à 115°, pendant un quart d’heure. On retirera de l’autoclave ; et pendant que la gélose sera encore liquide dans les tubes, on les inclinera convenablement en évitant avec soin que le milieu nutritif n’arrive jusqu’au coton.

Après solidification, la gélose des tubes inclinés tourne et ne présente pas d’adhérence avec le verre. Pour remédier à cet inconvénient, on disposera les tubes convenablement inclinés à l’étuve à 37°, pendant vingt-quatre heures sans les encapuchonner. Au bout de ce temps, la gélose s’est suffisamment desséchée sur les bords pour contracter adhérence avec le verre. La gélose laisse toujours exsuder un peu de liquide ; aussi les tubes ensemencés destinés à séjourner à l’étuve à 37° doivent être garantis de l’évaporation par un capuchon en caoutchouc.

Dans le fond du tube, les cultures sont toujours plus

abondantes à cause de Thumidité condensée : le bacille typhique peut y former une pellicule finement irisée.

Comme renseignements complémentaires, nous ajouterons que la gélose, ou agar-agar, est une algue floridée qui cède à beau chaude une matière, dont le pouvoir gélifiant par refroidissement est dix fois supérieur à èelui de la gélatine. Son maximum de solubilité est de 1^%50 0/0; et, encore, à cette dose, il existe des parties qui ne se dissolvent pas et tombent au fond.

La solution de gélose dans beau donne un liquide gris qu’il est indispensable de coller et de filtrer rapidement et en grande masse à chaud pour éviter un refroidissement rapide et donner le temps de répartir en tubes.

Malgré cela, la gélose refroidie est toujours un peu opaque ; et les divers traitements préconisés pour éviter cet inconvénient sont insuffisants pour lui donner une limpidité parfaite.

La gélose longtemps échauffée avec le bouillon à 115° perd un peu de ses propriétés nutritives : aussi a-t-on conseillé de la préparer à plus basse température en se servant seulement de sa partie soluble dans beau, ou extrait aqueux de gélose. Dans ce cas, on stérilise par chauffage discontinu, et la répartition se fait dans les tubes préalablement stérilisés.

La gélose, qui peut supporter sans fondre une température voisine de 70°, offre la particularité remarquable de ne faire prise que très lentement et seulement vers 40°; ce qui permet à la rigueur d’y introduire des dilutions de microbes à cultiver qui y pousseront plus tard isolément.

L’ensemencement se fait en stries avec les tubes inclinés, et en piqûres avec les tubes droits. Les aérobies y

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poussent en surface en donnant un aspect souvent caracléristique : les cultures peuvent en effet être muqueuses, plissées, en rosace, en barbe de plumes, etc.

Quant aux anaérobies apportées par les vases de l’eau, ils donnent, ensemencés en profondeur, des gaz qui peuvent disloquer la gélose.

La gélose offre un caractère de moins que la gélatine : la liquéfaction. La gélose est en effet une cellulose très difficile à dissoudre par les diastases microbiennes ordinaires ; mais cette résistanceestsouventutilepourattendre l’éclosion de certains germes de l’eau à vitalité très diminuée, qui n’apparaissent souvent qu’après quinze jours et même davantage d’étuve à 37° ; alors que la gélatine, qui ne peut pas supporter cette température, est souvent complètement envahie, au bout de quelques jours d’étuve à 22°, par des liquéfiants qui empêchent toute numération et séparation précises de microbes.

8° Gélatine et gélose colorées par tournesol. — Les tubes de gélatine et de gélose colorés par tournesol, s’obtiennent en ajoutant goutte à goutte à ces milieux nutritifs, une solution aqueuse saturée de tournesol préalablement stérilisée et en quantité suffisante pour bien colorer le milieu en bleu. Ces tubes ainsi colorés pourront être inclinés ou réservés pour la préparation des boîtes de Pétri.

9° Pommes de terre. — La pomme de terre est un milieu très recommandable qu’on trouve partout, et qui donne des cultures assez caractéristiques avec beaucoup de bactéries rencontrées dans les eaux ; notamment avec le Bacterium coli, le Bacille d’Eberth, le stapliylocoque pyogène doré et les bacilles chramogènes. C’est un milieu

complexe riche en sels, matières azotées et hydrocarbonées, à réaction un peu acide.

On choisira les jaunes, plus riches en amidon. On en découpera des rondelles à Femporte-pièce qu’on introduira dans de gros tubes étranglés adoptés dans quelques laboratoires pour ce milieu ; ou à défaut de ces tubes spéciaux on préparera des tranches qu’on introduira dans les boîtes de Pétri, et on les fera cuire à l’autoclave à 115° pendant trois quarts d’heure.

Les tubes étranglés sont préférables à la disposition en boîtes; car les liquides de cultures ne se mélangent pas au milieu nutritif. Ces tubes doivent toujours être recouverts d’un capuchon de caoutchouc préalablement stérilisé.

Les cultures sur pommes de terre brunissent en vieillissant, notamment celle du bacterium coli. Certaines levures retirées des eaux peuvent consommer l’amidon, donner des gaz et de l’acide butyrique, et diminuer ainsi graduellement le volume de la tranche primitivement employée.

10° Milieu dTlsner. — Ce milieu, fondé sur la résistance aux acides, est employé depuis plusieurs années comme milieu éliminatoire, car les bacilles autres que coli et le typhique y poussent très mal et très tardivement.

Le Bacterium coli y apparaît le premier en donnant des colonies assez développées ; tandis que le bacille d’Eberth ne se montre que plus tard sous forme de colonies à peine visibles sans le secours de la loupe.

On le prépare généralement de la façon suivante:

1° F aire macérer pendant quelques heures 500 grammes de pommes de terre râpées dans un litre d’eau distillée ;

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2° Filtrer, puis ramener au volume primitif en ajoutant de l’eau distillée ;

3° Ajouter 150 grammes de gélatine blanche coupée en morceaux ;

4° Faire fondre au bain-marie;

5® Neutraliser exactement avec une solution d’hydrate * de soude, puis ensuite ajouter un peu dejus de pommes de terre pour avoir un milieu franchement acide ;

6® Chauffer à l’autoclave un quart d’heure à 115®, puis filtrer à chaud comme pour la gélatine ordinaire ;

7® Répartir dans les vases de culture, puis stériliser à l’autoclave pendant un quart d’heure à 110® ;

8® Au moment d’employer le milieu, ajouter un centimètre cube d’une solution aqueuse stérilisée d’iodure de potassium à 10 0/0 dans chaque tube de 9 centimètres cubes et seulement 1/2 centimètre cube dans les tubes remplis à 4 centimètres cubes et demi.