V. — Coloration

Principe de la coloration. — La meilleure méthode décoloration pour la technique hématologique et protistologique est celle qui repose sur l'emploi d'un colorant neuti*e formé par un mélange d'azur de méthylène et d eosine. L'azur de méthylène prend naissance par l'oxydation du bleu de méthylène en présence des alcalis. Il existe beaucoup de formules pour préparer ce corps et on trouve dans le commerce un certain nombre de solutions toutes faites. Pourtant, au laboratoire de Parasitologie, après une expérience de plusieurs années, on préfère employer une solution de bleu de méthylène riche eu azur, préparée suivant la formule dite du bleu Borrel. On est sur d'avoir ainsi une solution de composition constante et des résultats toujours comparables.

Le bleu Borrel ou bleu à l'oxyde d'argent est une solution de bleu de méthylène chimiquement pur, qui a été mise en contact pendant quelques jours avec de l'oxyde d argent pur, puis qui a été filtrée. L'oxyde d'argent agit comme alcali faible et comme oxy-

(1) Cf. Instructions sommaires pour les pays chauda^ in-8*' de 11 p., il 05

TECHNIQUE MICRO.SCOPIQL'K' 147

dant : il décompose le bleu de méthylèDe et produit une grande quantité d'azur de méthylène, dont la présence est révélée par la teinte rougeàtre que prend la solution.

Le bleu Borrel est ensuite mélangé en quantité déterminée avec une solution d'éosine à l'eau de Hôchst. Le mélange est fait au moment de pratiquer la coloration et versé sur les frottis fixés. La préparation du bleu Borrel sera indiquée plus loin.

Technique de la coloration. — Le bleu Borrel est employé au laboratoire de parasitologie suivant une technique qui a été réglée par Brumpt en 1903.

l"" disposer sur la table les flacons de bleu Borrel, d'éosine et de tannin-orange : prendre un petit tube à fond plat qui servira à faire le mélange.

2^ Fabrication des compte-gouttes.

a — Prendre un fragment de tube de verre de 20 cent, de longueur.

b, — Chauffer sur un bec Bunsen le milieu de ce lube en le tournant entre les doigts.

c. — Quand le verre est suffisamment ramolli le retirer de la flamme et tirer doucement les deux extrémilés, de façon à effiler la partie centrale.

d. — Couper la partie effilée en son milieu au moyen dune lime fine.

On a ainsi deux compté-gouttes de même calibre. On les munit chacun d'une tétine en caoutchouc. Il est très important que les deux compte-gouttes soient égaux, de façon à pouvoir mesurer des quantités égales. On colle une étiquette sur celui qui est destiné au bleu. En effet, il est de la plus haute importance de ne jamais les confondre. Celui du bleu ne doit servir qu'au bleu.

3** Fabrication du mélange colorant.

Principe. — La teneur en azur du bleu Borrel varie suivant une foule de circonstances etnolamment suivant qu'il a été préparé depuis plus ou moins longtemps. 11 faut donc proportionner la quantité d'éosine à la quantité de bleu. Généralement on emploie 1 goutte de bleu pour 10 gouttes d'éosine ; mais, dans certains cas, il faut prendre 1 goutte de bleu pour 7,8,12,15... gouttes d'éosine. Vn premier essai renseigne sur les pro|)ortions à employer.

l\H M. LANGEIIUN

Technique du mélange.

i^ Avec le comple-goulles de l'éosiue faire tomber dans le petit tube 20 gouttes de solution d'éosine.

2° Avec le compte-gouttes du bleu faire tomber dans l'éosine mesurée dans le petit tube 2 gouttes de bleu Borrel.

30 Reprendre le compte-gouttes de Téosine et mélanger rapidement les deux coloi^uts en aspirant et refoulant à plusieurs reprises au moyen de la tétine en caoutchouc.

4<' Répartir le mélange sur les frottis fixés, bien sécbés et posés à plat sur la table.

5<> Etaler le colorant avec la partie effilée de la pipette, de façon à ce que toutes les parties du frottis soient imbibées.

Si la manipulation a été exécutée correctement, le liquide colorant doit être d'une belle teinte violet-rouge et ne doit pas précipiter immédiatement.

4® Coloration.

La coloration marche rapidement, elle est généralement complète en à 20 minutes. De temps à autre reverser le liquide dans le petit tube et regarder au microscope avec l'objectif 6 et Tocu laire 6. La coloration est suffisante quand les noyaux des leucocytes et ceux des parasites ont pris une belle teinte violet rougeâtre.

5® Di/férencintion.

a. — Laver rapidement dans de l'eau propre.

//. — Égoulter rapidement.

c. — Verser sur le froltis quelques gouttes de tannin-orange de llnna. Balancer la lame pour régulariserl'action du réactif. Laisser agir de 30 secondes à 1 minute.

G** Laver rapidement à l'eau.

7' Sécher entre plusieurs doubles de papier Joseph.

H' Déposer une goutte d'huile de cèdre sur le frottis et examiner directement sans lamelle.

O** Après examen, enlever l'huile de cèdre en lavant au xylol avec précaution, sécher au buvard et conserver à sec sans lamelle et sans monter au baume. Les préparations peuvent se conserver indéfiniment pourvu qu'elles soient à l'abri de la poussière.

Dans une préparation réussie, le protoplasma des globules rouges doit être coloré en jaune orangé, celui des parasites en bleu, le noyau des parasites en violet-rouge, le noyau des leucocytes en

violacé. Si la différenciation est insuffisante, on la recommence après avoir enlevé Thuile de cèdre avec du xylol.