HEC
Calcul
Du chiffre trouvé, déduire la quantité de permanganale de potasse N/100 nécessaire pour colorer un certain volume (environ 0,02 cc) d’eau distillée, égal au volume de la solution.
La quantité totale de permanganate employée est alors
de : pt à n emè - (0,02 cm (pour 2 cm# de sérum)
comme {1 em° de la solution N/100 de permanganate de
potasse corerspond à 0,2 mg. de calcium, il est facile d’en
tirer le taux de calcium par 1.000 cm de sérum :
pour 1.000 em de sérum nous aurons employé : 509 (n - 0,02)
cm de permanganate de potasse, ce qui donne 100 (n - 0.02)
mg. de calcium pour 1.000 cm° de sérum.
Nos dosages ont été faits en double dans des conditions identiques avec les mêmes pipettes et une solution de permanganate de potasse souvent vérifiée et renouvelée, étalonnée à partir d’acide oxalique normal.
Il. — Dosage du phosphore minéral et des phosphatases du sang.
Méthode A. Bodansky, modifiée par Paul Meunier et Yves Raoul.
Principe : Dosage parallèle du phosphore minéral du plasma avant et après addition d'un substrat renfermant un large excès de glycéro-phosphate de sodium. La différence de phosphore minéral constatée entre les deux dosages mesure l’hydrolyse effectuée par les phosphatases.
Mesure de l'activité phosphatasique : Nous nous sommes arrêtés à la technique proposée par Paul Meunier en raison de sa relative simplicité et de la possibilité que nous avions d'employer un électro photomètre de sa conception :
1° On opère sur le plasma afin d'éviter les phénomènes de phosphominéralisation autonome du sang provenant de lhydrolyse des esters phosphoriques des globules :
2° On fait agir la phosphatase du plasma qui serait surtout une phosphatase 8 sur le B glycérophosphate de sodium et dans les conditions optima d’action, C’est-àdire pH 8,5 à 38° ainsi quil est réalisé dans la technique Bodansky à l’aide d’un tampon de diéthylbarbiturate sodique. (Il n’a pas, aux doses utilisées, d'action inhibitrice sur les phosphatases. P. Meunier).
3° On se contente d’un temps d’action d’une heure dans une étuve à thermostat, de manière à éviter une disproportion trop grande et préjudiciable au dosage, entre les quantités de P minéral pré-existant et néoformé. De cette manière, même dans les cas de très grande activité phosphatasique, l’enzyme se trouve toujours en présence d’un grand excès de substrat. On a ainsi des conditions d'action aussi identiques que possible d’un sang à l’autre.
4 L'unité adoptée est celle proposée par Bodansky, la plus répandue actuellement ; elle s'exprime par le nombre de milligrammes de phosphore libérés par 100 em* de plasma agissant pendant 1 heures à 38° sur un substrat renfermant un large excès de B glycérophosphate de sodium à pH 8,6.
Dosage du phosphore minéral :
La méthode la plus sensible, en vue d’un sub-microdosage, est celle qui mesure l'intensité de la coloration bleue du complexe phospho-molybdique réduit. On emploie les réducteurs du type photographique qui permettent la préparation de réactifs de conservation assez longue. Dans les conditions du dosage et aux doses de phosphore rencontrées, l’intensité des colorations suit parfaitement la loi de Beer,
Le 0
Sub-microdosage des phosphatases du plasma :
Réactifs :
\ 1° Substrat de Bodansky :
Glycérophosphate de sodium. .... RER 2,5 gr.
Diéthylbarbiturate de sodium ........ 2,12 gr. Fau brdistillée;/ ds. 2772200000 500 cm 2e Solution NaCI à 1,8 %. 5 3° Acide trichloracétique à 25 %.
4° Réactif A :
Molybdate d’ammonium ........:..... 2,5 . gr. Acide sulfurique (6 Ne ae 100 cm° 5° Réactif B Sulfate de monométhylparamidophénol 05 gr.
SONasEr a 15) 007 NC HR RS 195 cm?
SON A OR ECO NAN ee sr 1 D cm*
| Toutes les solutions sont faites dans l'eau bi-distillée. Mode opératoire :
Dans une fiole jaugée de 5 cm$ mélange fs F Fiole T : à Substrat réchauffé ........:...! Riu 1 cm° AT + NaCTAALS % RS RE RERO Cet 0,1, cm Eau bi-distillée ...... F1 LUEUR 0.1 cm?
CiLCR COOH 8,28 ER PCR ER 0,2 cm$
« à Les + Dans deux tubes'coniques à centrifuger, verser :
Tube IT:
NaCE ACL EEE L'NR SERRE SD TEE
PIasMAU PEER TE ht PC PRORNEEENTARSe L O,1 cm Tube IT :
Subatrat réthauffé à 3820 memt/ 2m 1 cm°
NaGIr 8 "1,80 70 EPS ASE US 0,1 cm
Plasma" ne CR RE 0,1 cm5
Laisser le tube II exactement 1 heure à l’étuve à 38°.
Arrêter l’action des phosphatases en mettant le tube immédiatement dans l’eau glacée.
Ajouter dans le tube TI: 1 cm de substrat, puis dans les tubes I et IT : 0,2 cm5 d'acide trichloracétique. Centrifuger.
Décanter dans les fioles jaugées de 5 em ; ajouter au culot 0,1 cm$ d'acide trichloracétique à 25 %. Mélanger, centrifuger, décanter dans les fioles de 5 cm correspondantes.
Enfin ajouter dans les fioles T, I et IT.
SOIT LOU A ROC MM de Pme. PA Ps 1,5 cn DOLLUON BST AIRE, CONTRAT ARE Le 15cm?
Fou Didistiiléé-cqfiis: DL ir 5 cmt
Agiter, laisser une demi-heure à la température du laboratoire et faire la lecture à l’électrophotomètre, (Nous avons employé la cuve de 10 mm. et un diaphragme réglé à 9 et une longueur d'onde correspondant au rouge).
Calcul : Soient n, N et N° les chiffres lus sur le tambour de l’électrophotomètre pour les fioles T, I et IT : P minéral dans 1 cm3 = (N -n) X m P libéré par les phosphatases en unité Bodansky : (N’- N) X m/10 n représente l'absorption due à la cuve remplie avant l'apparition de la coloration bleue ; m est la variation de concentration correspondant à une division du tambour. Elle s'exprime en milligramme ou en dixième de mgr. par em? par exemple. Le calcul de m s'effectue une fois pour toutes pour uné cuve, un écran donné et pour les réactifs que l’on vient de préparer : c’est la moyenne de 4 à 5 déterminations faites sur des concentrations différentes et connues.
Pour ce faire on prépare une solution étalon contenant 0.4 mgr. de P par 5 em° (80 mgr. par litre).
PDA à EL
Préparation de la solution étalon :
Faire dissoudre 0,350 gr. de phosphate monopotassique pur dans l’eau distillée ; verser dans un flacon gradué à 1 litre, ajouter 10 ce. de SO#HION, compléter à un litre avec de l’eau bi-distillée (pour plus de précision : dissoudre 3.509 gr. de phosphomonopotassique dans 100 ec. d’eau bi-distillée et mettre 10 ce. de cette solution dans le flacon yradué).
La conservation de la solution est pratiquement indéfinie. 0,1 cc. de cette solution contient 0,008 mg./1. de phosphore. On prépare deux autres solutions en mettant par exemple :
30 ce. de solution étalon de 70 cc. d’eau ; 0,1 ce. de cette solution contient 0,0024 mgr. de phosphore ;
= 80 ce. de solution étalon dans 20 ec. d’eau ; 0,1 ec. de cette solution contient 0,0064 mgr. de phosphore.
Malheureusement les réactifs À et B, surtout B, ne sont pas particulièrement stables. Très rapidement il se produit une réduction de lintensité de la coloration du complexe phosphomolybdique pour une même dose de phosphore. Il s’en suit qu’il faut très souvent recalculer le facteur m qui dépend de létalonnage. .
Aussi nous avons préféré reprendre les réactifs employés dans la méthode de Briggs. Ce fait est sans importance, seules les conditions d’hydrolvse et non le mode de dosage sont significatives. £
Réactif molybdique :
Dissoudre 25 gr. de molybdate d’ammonium dans 300 ce. d’eau distillée.
Ajouter la solution :
SO'H2: concEmMré is IE AR 15 cc.
audi dis tilés A AN ETE TLURR 125 cc.
