CHAPITRE PREMIER
LA CULTURE DU STREPTOBACILLE DE DUCREY 6
Nous avions besoin de connaître les études sur la culture du bacille de Ducrey pour nos recherches personnelles et il nous a fallu tout un travail bibliographique pour amasser ce que l’on a publié sur la question, Sans doute cette littérature est-elle moins abondante que celle qu’a entraîné l’étude de certains microbes, Mais elle a cependant été très étudiée, surtout dans ces dernières années.
On sait en effet toute l'importance pratique de cette culture. À vrai dire elle n’a pas encore une valeur diagnostique (24). Les échecs sont encore trop fréquents, même lorsqu'on s'adresse aux cas les plus favorables au point de vue bactériologique. Plus que dans toute autre affection, la réponse négative du laboratoire ne veut rien dire dans la chancrelle., Mais à mesure que l’on précisait les techniques d’ensemencement, la composition
Po
des milieux, la morphologie des colonies, la culture devenait moins difficile, au point que ce n’est plus maintenant un fait remarquable d'obtenir uae culture pure du streptobacille.
La culture du streptobacille permit de multiples essais thérapeutiques. Et lorsque l’on fait l'historique du traitement de cette affection, on est frappé du parallélisme des progrès de la bactériologie et du traitement. La chancrelle a cessé d’être « la honte de la dermatologie » du jour où Reenstierna et Nicolle ont pu obtenir avec assez de constance des cultures pures du bacille de Ducrey,
Historique
Ducrey (14) n'avait pu obtenir de cultures du germe qu’il a décrit. Il l'avait obtenu à l’état pur, en faisant des autoinoculations en série ; se servant donc in vivo de la méthode que les bactériologistes emploient habituellement in vitro, il décrit un bacille gros et court mesurant Op 90 et 2 u à bonts arrondis. Il a souvent la forme d’un 8, c’est-à-dire avec une dépression latérale de chaque côté; cette dépression du reste peut manquer.
Va verticalement, il semble un coccus ; il est ordinaiment en anias ou isolé, le plus souvent libre ou dans les globules du pus. Il se colore à la fuchsine et au violet de gentiane, mais sans prendre entièrement la couleur qui se fixe particulièrement à ses extrémités. Il ne se colore pas par la méthode de Gram. |
Unna (52) critiqua la spécificité du bacille décrit par
Ducrey. En faisant l’étude anatomopathologique du Chancre mou, il trouve dans la couche malpighienne un bacille différent. C’est un bacille en chaïîneltes de 5 à 10 éléments et plus, parallèles à la surface du chancre et n’envahissant pas le tissu cellulaire sous-cutané.
- Individuellement, lesmicrobes sont de dimensions plus petites que celles données par Ducrey, le microbe se colore en entier. Ses extrémités sont carrées. Le bacille ne prend pas le Gram. |
Cest à Nicolle (38) que revient l’honneur d’avoir réfuté Unna.
Analysant dans sa thèse les résultats de l’examen anatomopathologique de 26 chancres mous, il montre que si dans la profondeur de la muqueuse, le bacille a bien l’aspect décrit par Unna, à la superficie on a la morphologie du bacille de Ducrey. Et il écrit « la transition se fait d’une manière si évidente qu’il est impossible d’avoir le moindre doute sur l'identité du bacille du pus et du chancre » Nicolle, thèse (38).
Nicolle n'avait pas alors cultivé le streptobacille. Strauss partant du pus des bubons n’avait pas été plus heureux. Nous ne ferons que citer les tentatives douteuses de Ferrari (18), celles de Petersen (53) qui se sert de gélose sérum (1893). Islomanoff et Alaspiam (28) sur gélose ascite (1893). Lenglet (34) montra en 1898 une culture pure de streptobacilles. Mais à notre connaissance, il ne publia jamais la composition de son milieu contenant, disait-il, seulement « des ferments parliculièrement actifs » el à base de peau humaine,
En réalité l’histoire de la culture du bacille en navette
ENS Le
commence en 1900 par la communication de Bezançon, Griffon ét Le Sourd (6).
Ils se servent de leur milieu au sang (7). On sait qu’il s’agit de gélose répartie en tubes ou fioles d'Erlenmayer, liquéfiée au bain-marie à 50° et dans lequel on incorpore 1/3 de sang de lapin prélevé directement el aseptiquement dans la carotide. Les auteurs ont donné une description parfaite des cultures : « À la surface des tubes ainsi ensemencés, on voit apparaître, après un séjour de vingt-quatre heures à l’étuve à 37°, des colonies arrondies, saillantes, brillantes, qui atteignent leur complet développement en 48 heures, et sont alors opaques, grisâtres, présentant 1 à 2 millimètres de diamètre. Lorsqu'on les prélève pour l’examen microscopique, elles ont tendance à fuir en masse devant le fil de platine, glissant à Ja surface du milieu, et sur la lamelle, sont difficiles à dissocier ».
Dans ce milieu, le germe a sa morphologie {ypique en chaînettes. Il conserve une vitalité extrême : il peut être repiqué après trois semaines de séjour à l’étuve ; il donne un chancre d’inoculation typique au onzième repiquage. Enfin les auteurs montrent que si en 24 heures on ne perçoit pas de colonies sur le milieu, il arrive que l’on trouve des chainettes typiques dans l’eau de condensation.
Malgré l'importance de ce travail on peut dire que les cultures réussies demeurèrent rares. C’est à la suitedes travaux de Reenstierna que les tentatives heureuses se mulliplièrent, donnant lieu à une efflorescence de travaux que nous allons tenter de résumer ici.
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Milieux de culturé pour le bacille de Ducrey
A. — Milieux au sang de lapin
: On peut dire que les milieux au sang de lapin sont au streptobacille ce que sont pour le gonocoque la gélose ascite ou le sérum de bœuf coagulé pour le bacille dipbtérique. C’est le milieu qui a été le plus souvent employé par les différents auteurs. Tous les modes de préparation que nous allons indiquer dérivent de la formule de Bezançon et Griffon. A notre point de vue il présente deux inconvénients : tout d’abord il est difficile d'obtenir plus de 100 à 150 cm° de sang même en sacri: fiant le lapin. D'autre part, il nous a paru impossible de juger du travail de la bactériophagie dans ce milieu. Le premier en date de ces milieux est celui de Reenstierna. |
1° Milieu de Reenstierna (Cf. 44)
C’est une gélose au sang de Bezançon-Griffon modifiée.
Cet auteur décrit ainsi sa préparation : « 1° On fait fondre 60 cm? de gélose nutritive # 3,5 % d’agar dans une fiole ; 2° on laisse refroidir jusqu’à 60°; 3° on additionne de 30 cm° de sang de lapin défibriné ; 4° on maintient ce mélange dans un bain-marie réglé entre 60 et 63° pendant 5 minutes ; 5° on répartit en tubes (5 cm dans chacun) qu’on incline ; 6° Il est nécessaire de ne pas porter les tubes à l’étuve ainsi qu’on le fait d’ordinaire pour contrôler la stérilité du milieu avant l’ensemencement ».
« Pour réussir l'isolement du streptobacille on doit employer un milieu préparé le même jour. Pour les passages, des tubes âgés même d’une semaine sont utilisables si on les garde à la glacière ».
Avec ce milieu Reenstierna a réussi 12 fois sur 18 à cultiver le bacille de Ducrey, parfois en culture pure d'emblée, si lon partait d’un chancre d’inoculation. Il n’a jamais réussi à oblenir une culture pure en parlant d’un chancre spontané, les tubes étant envahis de streptocoques et de paradiphlériques. Il conseille d’ensemencer largement et de très nombreux tubes de (10 à 20), ce qui est difficile c’est d'obtenir la première culture : « dès la deuxième génération, les repiquages marchent bien » les cultures sont plus abondantes, l’auteur repique tous les jours.
2° Milieux de Nicolle. MiciEu D'ISOLEMENT (Nicolle 39).
C’est un milieu de Reenstierna modifié. On l’obtient « en stérilisant dans une fiole d'Erlenmayer 90 gr. de gélose nutritive à 3 % d’agar et en ajoutant 20 gr. seulement de sang défibriné de lapin ».
MILIEUX D'ENTRETIEN. — On se sert soit de la gélose soit d’un milieu liquide.
Bouillon Martin. . . . 100 grammes Sang défibriné de lapin . 20 »
Dans ce milieu, la culture se développe en grains, parfois adhérents aux parois. Au bout de quelques jours, il se fail à la surface du milieu un voile incom-
BUS Ke jee
plet dont les fragments tombent au fond du tube par agitation.
En maintenant les tubes à l’éluve à 35° on conserve les bacilles vivants pendant 10 jours, en bouillon et sur gélose 3 ou 4 jours ; la 1/2 des tubes peuvent être re: piqués jusqu’au 10° jour.
MitiEU DE CONSERVATION. — En dehors de la gélose molle dont nous donnerons plus loin la formule et qui est du reste un milieu moins favorable, Nicolle se sert d’une gélose molle sanglante :
Gélose à 2,50 %, d’agar ;
1 0 d’amidon de fécule de pommes de terre ; 0 ,
20 % de sang défibriné de lapin.
Le microbe, sur ce milieu, peut toujours être repiqué après 3 à 4 semaines. Souvent les repiquages sont possibles après six semaines,
3° Autres milieux au sang de lapin.
De Assis (1) donne une formule analogue, Il insiste sur l'importance qu’il y a à chauffer le milieu à 55 degrés au bain-marie pendant 5 minutes après le mélange du sang. De même Nicolau et Banciu (42) chauffent leur gélose sanglante pendant une demi-heure à 60°. Leurs milieux sont donc très voisins de celui de Reenstierna,
B. — Autres milieux au sang 1° Milieux au sang de mouton de Durand.
Durand (15) décrit deux milieux au sang de mou-
ton.
Bassër | e) #
GÉLOSE Au SANG. — Il se sert d’une gélose nutritivé dans laquelle il introduit du sang de moulon défibriné, dans la proportion d’un 1/3 à 1/5 du volume total:
Le bacille de Ducrey y pousse en 36 à 48 heures. Mais les microbes associés y poussent également: L'auteur recommande alors d'utiliser le sang de mouton pur.
SANG PUR. — On le prélève aseptiquement à la jugulaire, le répartit en tubes qu’on incline, le sérum transsude en quelques heures. C’est sur un tel milieu qu’on ensemence. Il est difficile d’y voir des colonies. Il faut s'assurer de la multiplication des microbes par des examens sur lame. Dès que les bacilles apparaissent, on repique sur la gélose au sang de moulon décrite ci-dessus. Les streptobacilles poussent maigrement sur ce milieu ; mais l’avantage de la méthode consiste en l'élimination des germes associés, qui ne se développent pas sur le caillot de sang. L'auteur peut alors partir d’un chancre spontané sans avoir à recourir au chancre d’inoculation. Il se borne à faire une détersion soigneuse à la compresse de la surface de lPulcération ; un tamponnage à la teinture d’iode de trois à quatre minutes, suivi d’un lavage rapide à l’alcool permet de se débarrasser de la plupart des germes associés. Dès que l'alcool s’est évaporé, on peut faire le prélèvement. On se sert de la pipette en aspirant la sérosilé obtenue par
pressions latérales du chancre.
2° Milieu au sang de cheval de de Assis.
De Assis (1 et 2) décrit ainsi le milieu qu'il a uti-
lisé,
To
Gélose à base de bouillon de veau et contenant : peptone de Parke et Davis 4 % ; phosphate disodique 1,5 % ; sang défibriné de cheval 1/2 ou 1/3. du volume total.
Il aurait obtenu des cultures pures d'emblée en partant de chancres spontanés. On sait que c’est avec ce milieu qu’il a étudié des streptobacilles vivants en saprophytes dans l’urètre normal, et dont il a montré la ressemblance avec le bacille du chancre mou sans ce-
pendant se croire autorisé à conclure à lidentité des deux germes (de Assis (2)).
3 Milieu au sang humain de Nicolau et Banciu.
Nicolau et Banciu (42) recommandent le mélange sui: vant, en se basant sur le développement excellent du germe dans l’eau de condensation des tubes de sang,
Eau physiologique à 8 gr. 5 de chlorure de sodium par litre, peptone 1 %.
Stériliser à l’autoclave et ajouter :
sang humain défibriné dans la proportion de 1/5 du volume.
Les tubes sont utilisables dès le lendemain,
Le sang s’amasse au fond du tube. C’est dans ce culot qu’il faut chercher le bacille, et dans les couches Îles plus proches de l’eau peptonée ; on l'y trouve déjà 24 h. après l’ensemencement, et surtout après 48 heures,
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Le germe présente une grande vitalité dans ce milieu. Il peut être repiqué jusqu’au vingtième jour, il reste vivant à la température du laboratoire après quelques jours d’étuve à 35°.Mais il perd sa virulence après 15 à 20 jours de culture.
Notons que Nicolle dans son travail des archives de l’Institut Pasteur de Tunis (40) indique que les milieux au sang humain semblent impropres à lisolement du bacille de Ducrey. Il n’indique pas du reste la formule du milieu dont il s’est servi. Il n’a pu obtenir la culture qu’en acclimatant progressivement et lentement le germe en une {trentaine de repiquage.
C) Milieux au sérum
Nous rappelons pour mémoire que c’est sur la gélose sérum que Petersen (43) avait obtenu une des premières cultures du streptobacille. D’après Nicolau et Bauciu (41) ce qui compte dans les milieux au sang c’est l'hémoglobine des globules rouges et non pas le sérum ni les leucocytes.Le streptobacille en effet,selon Frei (21) hémolyserait les globules rouges. De plus, un même streptobacille serait doué d’un pouvoir hémolytique inégal visà-vis des globules des différents groupes sanguins. Nous voyons peut-être là une raison aux différences d'appréciation que lon note chez les auteurs vis-à-vis de tel ou tel milieu sanglant,
1° Sérum non coagulé de lapin.
Dans leur article déjà cité, Bezançon Griffon et Le Sourd (6) communiquent les résultats qu’il ont obtenus
ENS 1e
en se Servant de sérum non coagulé de lapin employé pur «le milieu se trouble légèrement, écrivent:ils, ct présente de petits flocons ».
Le microbe se présente sous forme de longues chainettes à l’examen sur lames. Mais la vitalité du microbe est faible, nécessitant des repiquages fréquents.La culture reste toujours maigre.
2 Gélose au sérum de cheval de Nicolau et Banciu
Ces auteurs (41) emploient une gélose albuminée au sérum de cheval et préparée comme une gélose ascite. Ils font pousser sur ce milieu les souches de streptobacille, obtenues après isolement sur leur milieu à leau peptonée sanglante. Cela suppose un certain acclimatement du germe aux milieux artificiels, d’une durée extrêmement variable suivant les souches, allant de quelques semaines à quelques mois.
Il faut ensemencer largement,et l’on obtient en 24 heures des colonies grisâtres non confluentes. Ce milieu serait pour Nicolau et Banciu très supérieur à la gélose molle ascilique qu'ils ont expérimentée sans avoir de
bons résultats. È
3° Milieu au sérum formolé de Legroux
Ce milieu de culture est indiqué par de Assis (1).
Bouillon de bœuf ;
peptone Parke et Davis 2 % ;
ou peptone.d’estomac de porc 2 % ;
sérum formolé de Legroux 10 du volume lotal,
