EMPLOI DE LECITHINES DANS LA COAGUL1- TION PAR LA TRYPSINE

Losqu’on emploie la trypsine pure, comme agent actirateur de la coagulation, les facteurs thromboplastiques plaquettaires influent sur le temps de formation du caillot.

Il était nécessaire d'éliminer ces facteurs activants 1bérés par les thrombocytes pour parvenir à titrer uniquement la prothrombine plasmatique.

De même que Witts à utilisé dans ce but les propriétés activantes des lipoïdes de l'œuf, nous avons étudié l’action des lécithines sur la trypsine en nous servant d'ovoléeithine officinale.

a) CONCENTRATION DES LÉCITHINES À EMPLOYER :

En ajoutant des lécithines à une solution de trypsine,

le temps de coagulation diminue et peut devenir égal à 25 secondes et même moins pour un plasma normal.

Il était nécessaire de déterminer quelle devait être la concentration en phospholipides.

Pour cette étude, nous avons préféré utiliser une suspension d’ovolécithine dans du sérum physiologique à 9 p. 100 plutôt qu’une solution alcoolique dont le pH, diminuant avec le temps, doit être constamment vérifié. L'acidification de la suspension faite en sérum physiologique est beaucoup plus lente.

Pour déterminer ce taux de lécithine à mettre en suspension, nous avons cherché la quantité de ce corps qui permettait d'éliminer les facteurs activant lipoïdiques d’origine plasmatique. Pour cela, nous avons partagé ur plasma normal en deux parties : l’une est gardée une heure à température normale, l’autre est portée à basse température dans la chambre frigorifique d'un frigidaire, pendant le même temps. Les plaquettes libèrent alors leur activateur thermostable dans le tube refroidi. Il suffit donc de déterminer le taux de lécithine pour lequel les temps de coagulation par la trypsine des deux échantillons de plasma, sont égaux.

La concentration optima ainsi obtenue correspond à 2 p. 100 d'ovolécithine.

Voici la technique de préparation de cette suspension

On broie dans un mortier 0,4 gr. (*) de lécithine d'œuf avec 10 ce. de sérum physiologique à 9 p. 1.000 ; on obtient une suspension à particules très fines qui servira dans le dosage.

b) MODE D'ACTION DE LA LÉCITHINE :

Nous avons pu montrer que cette lécithine qui diminuait de près de moitié le temps de coagulation par la trypsine, n'avait par contre aucune action sur le temps

(*) Comme, on pratique, on mélangera en parties égales, trvpsine et lécithine, il faut préparer :

— Une solution de trypsine à 5 p. 100,

— Une solution de lécithine à 4 p. 100.

Plutôt que de mélanger les deux produits, on peut ajouter séparément 0,1 ec. de chacun, ce qui revient au même quant au litre des solutions à préparer,

de coagulation du plasma recalcifié (temps de Howell). C’est ce que résume le tableau suivant :

Tableau 8 Temps de Howell Origine des Plasmas Temps de Howell mn rie

Sujet normal see ane 3 min. 3 min. 35 SUICRÉROLNAlMN er EC ere 2 min. 40 8 min. 45 ACCOUCROCR Te SAC PR RE ST è min:20 2 AIN: V80 ICRÉTIQUE Rene a ” 4 min. 30 4 min. 30 Phlébite traité par 800 mgr.

déSdICOUMATME FERA 8 min. 40 JANINE 0

Il est de même remarquable de constater que presque constamment il y à un léger allongement du temps de coagulation. Cette augmentation est très marquée pour les plasmas provenant de sujets ayant reçus du dicoumarol, ainsi que Witts l’avait noté.

Pour avoir un point de comparaison, nous avons extrait par le chloroforme les lipoïdes provenant d'une thromboplastine préparée par la méthode de Quick. Le chloroforme à été ensuite soigneusement évaporé et l’extrait traité par un mélange éther-alcoo]l en parties égales. Après évaporation à 60°, sous vide faible, de l’éther-alcoo!l, nous avons obtenu une pâte ayant l'aspect des lécithines commerciales. Nous n'avons malheureusement pas pu déterminer sa teneur en azote et en phosphore.

L'action de cet extrait lipoïdique n'est pas absolument comparable à celle de l’ovolécithine ; il semble pouvoir accélérer le temps de Howel bien que nos observations ne soient pas sur ce point absolument démonstratives: le temps de coagulation par le mélange trypsine-lipoïdes cérébraux, ne tombait pas aussi bas qu'avec le mélange trypsine-lécithine d'œuf. Il est possible que la concentration de notre extrait en produits actifs ait été plus faible que celle de l'ovolécithine. Toutefois, l’utilisation de solutions contenant des taux croissants de lipoïdes cérébraux n'a pas raccourci ce temps. Il est probable qu'il existe des différences importantes entre l’ovolécithine et l'extrait lipoïdique de cerveau en ce qui concerne le taux des céphalines et les impuretés,

Ceci peut expliquer la différence d'action des deux produits.

LE FIBRINOGENE :

Si nous ne pensons pas que le taux du fibrinogène joue un grand rôle dans la mesure du taux de prothrombine par la méthode de Quick, nous sommes, par contre, persuadé que limportance de la fibrinémie est très grande lorsqu'on étudie la coagulation par la trypsine. Au bout de 48 heures de conservation des plasmas dont le taux de fibrinogène était déjà bas à Pétat frais, cessent d’être coagulables par le mélange trypsine-lécithbine. Le temps de coagulation d’un plasma frais peut être allongé de 10 à 12 secondes dans les fortes hypoñibrinémies ce qui introduit une énorme cause d'erreur; ceci est certainement dû à la digestion du fibrinogène qui est toujours associée à Ja coagulation par la trypsine.

DOSAGE DE LA PROTHROMBINE PAR LA TRY P- SINE : l

a) TECHNIQUE :

Des études que nous venons de faire et que le temps ne nous à pas permis de pousser plus loin, il ressort qu'il est théoriquement possible de doser la prothrombine par le mélange trypsine-lécithine mais non par la trypsine pure Voici la technique que nous avons utilisée :

Le sang est recueilli comme pour un dosage de prothrombine par la méthode de Quick.

Deux solutions de trypsine : l'une à 2,5 p. 100, l’autre à 5 p. 100.

Une suspension d'ovolécithine à 4 p. 100.

Dans un bain-marie à 38°, on met un tube à hémolyse dans lequel on ajoute dans l'ordre :

MASTER SLI SET PRES (CAES

Chlorure de calcium à M/20 ............ (CT

ARR A ENIES ADS LR ederetece 0,2 ce.

On déclanche alors le chronographe et on mesure le temps de

coagulation. | Avec le même plasma, on procède à une seconde détermination :

DVD MO APE TOME NT eee: otre Chlorure dencalciurmaeM/20. ............ 02e. Panne Er FMI RER (MAC:

PAS MARI TOS RP terne en Ne Drercc:

On détermine ainsi un deuxième temps de coagulation.

Nous pouvons donc obtenir pour un même plasma :

— Le temps de coagulation par la trypsine pure,

— Le temps de coagulation par le mélange trypsinelécithine,

— Une lécithine différence qui représente de grandes analogies avec celle de Witts.

b) INFLUENCE DES VARIATIONS DU TAUX DE PROTHROMBINE :

Nous n'avons étudié l'influence des variations du taux de prothrombine que sur le mélange trypsine-lécithine.

Il suffisait, après avoir mis au point une méthode de dosage à vérifier au point de vue pratique que les variar tions du taux de prothrombine correspondaient à une augmentation continue des temps de coagulation; ceci

€ sec

25 930 75 409 %, prothrom bine FIG. 8 : Courbe montrant l'augmentation du temps de coagulation par le mélange trypsine-lécithine avec la diminution du taux de prothrombine (facteur B de Quick)

revenait à dresser une courbe d'étalonnage du mélange trypsine-lécithine pour un plasma normal, exactement comme nous l'avions fait avec une solution de thromboplastine dans la méthode de Quick.

Se

Etant donné lFimportance du taux de fibrinogène dans le dosage, il-était nécessaire d'utiliser, pour diluer le plasma normal, un plasma déprothrombiné. Il fallait donc vérifier tout d'abord que le mélange trypsine-lécithine ne coagulait plus un plasma traité par le sulfate de baryum. Aucun caillot n'étant apparu après adsorption du facteur de la prothrombine, nous pouvions donc employer ce plasma pour faire les dilutions.

Après avoir fait varier les concentrations en prothrombine entre 10 p. 100 et 100 p. 190, nous avons dressé lx courbe étalon en portant en ordonnées les temps en <«econdes et en abcisses les concentrations pour 100. La graphique est représenté sur la fig. 8: il est assez semblable à celui obtenu par la méthode de Quick.

En portant en abcisses les logarithmes des concentrations p. 100 et en ordonnées les logarithmes des temps en secondes, nous avons obtenu la courbe de la figure 9 :

[og E

log C F16. 9 : Application de la formle de Fischer

à la coagulation par le mélange trypsine-lécithine.

La partie de cette courbe qui correspond aux concentrations inférieures à 50 p. 100, semble plus rectiligne que lors-

ATOS que nous avions utilisé la méthode de Quick pour déterminer les temps de coagulation (fig. 3). Toutefois, l’utilisation de la formule de Fischer ne nous paraît pas recommandable.

a) RÉSULTATS :

Nous n'avons pas eu la possibilité de réunir beaucoup d'observations. Dans un tableau synoptique, nous rapportons 29 mesures où sont comparés le temps de Quick, Je temps de coagulation par la trypsine seule et le temps de coagulation par le mélange trypsine-lécithine (tableau 9).

Nous voyons que dans ce tablean lPapproximation n’est pas très satisfaisante. Pour des plasmas normaux, les temps trouvés oscillent entre 19 et 30 secondes lorsqu'on emploie le mélange trypsine-lécithine et entre 38 et 64 secondes lorsqu'on emploie la trypsine seule. Dans ce dernier Cas, les écarts sont plus compréhensibles.

La lécithine-différence que nous avons pu calculer pour un certain nombre de plasmas normaux, varie entre 20 et 3S. Dans un cas de purpura rhumatoïde que nous n'avons pas rapporté ici, elle a été de 1 minute 20 secondes.

Les variations que nous enregistrons ne permettent pas l’utilisation pratique du dosage, elles sont probablement dues à plusieurs causes : taux variable des antilysines plasmatiques et quantités différentes de fibrinogène suivant les échantillons de sang utilisés. D'autre part, le mélange trypsine-lécithine ne paraît pas doué de la même Stabilité que la thromboplastine de Quick et bien que le mélange des deux produits (trypsine et lécithine) se fasse au dernier moment, on peut enregistrer en dosant plusieurs fois un même plasma des variations de temps assez importantes. 1

Une mise au point de la méthode en tenant compte de ces causes d'erreurs devrait permettre d'obtenir des ré- Sultats plus constants.