C — METHODE DE TRAVAIL

Le microorganisme se développe sur un milieu salin synthétique en présence de glucose comme source énergétique et d’une source d'azote. Tout le phosphore initial offert sous forre# minérale est parfaitement déterminé.

A différents stades du développement nous recueillons : d’une part le liquide nutritif sur lequel on dose le phosphore total

et le phosphore minéral:

d'autre part le mycélium que l'on soumet à différents traitements et sur lequel on dose le phosphore minéral

le phosphore sous forme d’esters le phosphore lipidique le phosphore nucléique

et le phosphore résiduel.

Les résultats obtenus sont consignés dans des tableaux: le phosphore dosé est exprimé en millisramme et les durées de cultures sont données en heure.

Pour chaque expérience nous donnons les bilans de phosphore pour l'ensemble des cultures aui la constituent.

Le bilan de phosphore s'exprime ainsi:

Phosphore minéral initial = Phosphore total du liquide nutritif + Phosphore total du mycélium

Le phosphore total du mycélium étant renrésenté par la somme suivante:

Phosphore total du mycélium - Phosphore total acido-soluble + Phosphore lipidique + Phosphore nucléique + Phosphore résiduel

D — TECHNIQUES 1 — Choix du microorganisme —

Souche de Sterigmatocystis nigra, Van Tieg. (syn. Aspergillus niger, Van Tieg.) repiquée à intervalles réguliers sur

carotte.

2 — Milieu de culture —

Nous utilisons le milieu minéral de CZAPEK [18], préconisé par JACQUOT [30]. Sa composition est la suivante:

Phosphate monopotassique ............ il g Chlorure de potassium ................ 0,50 » Sulfate de magnésium 7. 0,50 »

Sulfate ferreux ...:.....:2:70 000 0,01 g Sulfate de ZINC Cr re oree O,01 »

Eau distillée .............. Q. S. pour 1000 cm

en présence de glucose (3°) et de sulfate n. d'ammonium (0,50°/, soit 0,106% d'azote). Le pH est amené à 5,0 par addition d'H,SO..

3 — Modalités culturales —

Nous adoptons la technique des milieux constants [21, [30]. C'est-à-dire que nous ensemençons simultanément une série de fioles qui sont retirées successivement de l’étuve. Nous utilisons des fioles d'Erlenmeyer de 500 cm, de même origine et de même calibre, dans chacune nous versons 200 cm: de liquide nutritif, ce qui correspond à une hauteur de 3 cm. environ. Chaque fiole est ensemencée à l’aide de 20 gouttes d’une suspension de spores fraîches dans du sérum physiologique (NaCI à 8 D. 1000). Les fioles bouchées au coton sont maintenues à l’étuve obscure à une température de 36 à 37° C.

4 — Microdosage du Phosphore —

La microméthode molybdomanganimétrique de THIVOLLE [751], [761 a été adoptée. Elle comporte: la précipitation du phosphore des orthophosphates en phosphomolybdate d'ammonium par le réactif molybdique sulfurique (R.M.S.), réduction de ce complexe dissous en milieu alcalin var le zinc et l'acide sulfurique en sesquioxyde de molybdène, et titrage final par la molybdomanganimétrie en utilisant le réactif molybdique phosphorique benzidiné avec des solutions de KMnO, à 0,8 p. 1000.

La technique originale n’a pas été modifiée, sauf en ce qui concerne l'appareillage de filtration: le précipité de phosphomolybdate d’ammonium et la solution de sesauioxyde de molybdène ont été filtrés sur microfiltres en verre fritté Schott-Jena, respectivement I G4 et I GS.

5 — Minéralisation —

La méthode nitro-zincique attenante au microdosage du phos-

phore et décrite par THIVOLLE [76] nous a donné entière satisfaction.

6 — Microdosage de l'Azote total —

Nous avons utilisé le mode opératoire décrit par BOIVIN [5]: micro-kjeldahl avec appareil de Parnas-Wagner. La minéralisation est exécutée à l’aide d'acide sulfurique pur en présence

du mélange catalyseur de BOIVIN (HgO + CuSO, + K,SO, à parties égales).

7 — Analyse des constituants phosphorés de la culture totale

À chaque prélévement le mycélium et le liquide sous-jacent sont versés sur un filtre sans plis, le total est lavé à l'eau distillée tiède. Le filtrat après ébullition et refroidissement est amené à un volume déterminé.

a) — Liquide de culture — On exécute une recherche qualitative du glucose à la liqueur de Fehling.

Sur ce même liquide on dose: d'une part Je phosphore total après minéralisation sur une partie aliquote; d'autre part le phosphore minéral sur une autre partie aliquote, par précipitation directe du phosphomolybdate d'ammonium par le R.M.S. (10 minutes au B.M. bouillant). Le phosphore sous forme d’esters est obtenu par différence entre le phosphore total et le phosphore minéral.

b) — Mycélium — Le mycélium lavé, essoré, est immédiatement haché très finement. La technique utilisée au cours de cette étude est inspirée de celle mise au point par SCHNEIDER [66] sur les tissus animaux et adaptée par VENDRELY [80] à la cellule bactérienne.

x — EXTRACTION DE LA FRACTION ACIDO-SOLUBLE —

La purée tissulaire est mise en suspension dans 100 cm° environ d'acide trichloracétique à 5% glacé et laissée à la glacière pendant 7 heures. L'’extrait acide est recueilli par filtration directe à travers une cartouche de cellulose pure, le résidu mycélien est lavé à l'acide trichloracétique à 5% glacé, puis à l’eau distillée jusqu’à faible acidité des eaux de lavage. L'’extrait trichloracétique total est amené à un volume déterminé.

Sur une partie aliquote on dose le phosphore total après minéralisation. Sur une autre partie aliquote on dose le phosphore

minéral (directement précipitable par le R.M.S.: 10 minutes à

100° C.) qui représente le phosphore des ortho-, pyro- et métaphosphates libres [471 et de l’acide adénylpyrophosphorique [771].

Par différence entre le phosphore total et le phosphore minéral on a le phosphore sous forme d’esters: esters glucidiques divers, nucléotides [50], [801].

y; — EXTRACTION DE LA FRACTION LIPIDIQUE —

Nous avons adopté la technique de KUMAGAWA et SUTO [36] modifiée par LEMELAND [38]. Le résidu tissulaire, dans la cartouche, est lavé à l'alcool à 95°, puis il est soumis à l’extraction alcoolique pendant 10 heures. L’extrait alcoolique est évaporé à sec sous pression réduite à une température inférieure à + 75° C. Le résidu sec est soumis à trois digestions dans l’ether anhydre puis à une digestion dans le chloroforme pur. Les extraits ethéro-chloroformiques laissent un résidu aui est minéralisé et dont on dose le phosphore aui représente le phosphore lipidique.

Le résidu insoluble dans les différents solvants est minéralisé, sa nature étant imprécise le rhosvhore qu'il renferme doit être considéré comme phosphore indéterminé.

Fc EXTRACTION DE LA FRACTION NUCLEIQUE TOTALE —

MICHEL-DURAND [51] n'avait pas obtenu de résultats positifs, il préconisait simplement la techniaue de JAVILLIER et ALLAIRE [31]: extraction par des solutions chlorurées, préférable à l'extraction trichloracétiaue même à température ordinaire. La méthode de SCHNEIDER nous a donné des résultats constants. Le résidu mycélien est désséché à + 40° C., pulvérisé très finement au mortier; la poudre obtenue est mise en suspension dans de l'acide trichloracétique à 5% froid, après centrifugation on jette ce liquide de lavage. Le culot est mis de nouveau en suspension dans de l'acide trichloracétiaue à 5°, le tout est soumis à l’action d’un B.M. à + 90° C. durant 15 minutes, après refroidissement et centrifugation on recueille l'extrait. Une nouvelle extraction trichloracétique est opérée dans les mêmes conditions, on recueille cet extrait qui est réuni au premier ; le total est amené à un volume déterminé: il renferme les deux acides nucléiques.

Sur une partie aliquote de l'extrait acide, après minérali-

sation, on dose le phosphore qui représente le phosphore des acides désoxyribo- et ribonucléiques.