TECHNIQUE

Tous les Insectes, et de même tous les Arthropodes, ne sont pas également favorables aux études microscopiques. Il est quelques types dont les ganglions nerveux ne se fixent pas d’une manière certaine et satisfaisante. Nous citerons en premier lieu le Dytique, genre qui se recommande par sa grande taille et son abondance en

toute saison; nous ne sommes jamais parvenu à avoir de bonnes fixations d’un ganglion thoracique ou abdominal de Dytique, même en faisant agir l'agent fixateur sur le ganglion vivant et mis à nu; nous attribuons notre insuccès à celte circonstance que le ganglion nerveux chez le Dytique est entouré et protégé par une membrane conjonctive relativement très épaisse, et que cette membrane oppose: un obstacle au liquide fixateur; ce dernier, en pénétrant dans l'intérieur du ganglion, trouve les cellules déjà altérées. Même difficulté, en ce qui concerne certains Crustacés; on obtient de bonnes fixations avec l'Ecrevisse, parce que la membrane d’enveloppe du ganglion est assez fine; au contraire, il en est tout différemment pour le Homard; ici, membrane épaisse, très résistante; et les cellules nerveuses du ganglion, après qu'on a fixé celui-ci, présentent une curieuse structure alvéolaire, qui paraît être une altération cadavérique. Il est de fait que si on prend la précaution de fendre le ganglion dans le sens de sa longueur, au moyen d’un coup de scalpel, avant de l'immerger dans le liquide fixateur, on obtient des cellules nerveuses qui ne présentent pas au même degré la pseudo-structure alvéolaire que nous signalons.

D'une manière générale, on peut remarquer que les ganglions sous-intestinaux sont protégés par une enveloppe beaucoup plus épaisse que celle des ganglions cérébroïdes, et que par conséquent ils sont beaucoup plus difficiles à fixer. Si on ajoute que ces ganglions contiennent des structures moins différenciées que celles des cérébroïdes, on comprendra de quelles difficultés est entourée leur étude.

Nous avons essayé un très grand nombre de liquides fixateurs, mais nous ne citerons ici que ceux qui nous ont donné de bons résullats : ce sont le sublimé et l'acide osmique.

Nous avons employé l'acide osmique, soit en solution alcoolique (liqueur de Ranvier et Vignal), soit sous la forme de liqueur de Flemming (formule de Fol), soit sous la forme de liqueur de Hermann, où, comme on sait, l'acide chromique est remplacé par le chlorure de platine ‘. Les liquides à base d'osmium ont de grands avantages pour l'étude de la substance ponctuée; ils produisent dans cette substance une différenciation qui en facilite l'intelligence ;

1. Pour la composition de ces liquides, je renvoie à l'ouvrage de MM. Bolles Lee et Henneguy, Traité des méthodes techniques de l'anatomie microscopique, Paris, 1887.

certaines régions de la substance ponctuée, sous l'influence de l'acide osmique, prennent une coloration foncée, qui les distingue d'autres régions, et permet de délimiter certains lobules importants. On s'aperçoit facilement des avantages que rend l'acide osmique à ce point de vue, si on compare une préparation traitée par l'acide osmique à une préparation fixée par le sublimé : dans ce dernier cas, la substance ponctuée a un aspect plus homogène.

Les pièces à fixer sont immergées dans le Flemming ou l'Hermann après une dissection rapide et incomplète faite à sec, où plutôt dans le sang même de l'animal, qui est le seul liquide vraiment neutre. Pour l'étude du système nerveux chez quelques larves, nous avons employé le procédé recommandé par Viallanes; ce procédé consiste à pousser une injection de liqueur de Flemming dans le corps de l'animal au moyen d’une seringue de Pravaz.

L'inconvénient de la fixation par l'acide osmique est qu'un séjour trop prolongé des pièces dans cet acide les charge d'osmium, les noircit à l'excès et rend les colorations difficiles. Nous avons pu, dans tous les cas, éviter cet inconvénient et débarrasser les pièces d’un excès d'acide osmique, et cela dans la mesure jugée nécessaire, — en employant le permanganate de potasse. Notre excellent ami M. F. Henneguy a montré récemment que le permanganale de potasse, en solution aqueuse étendue (1 0/0), constitue un très bon mordant qui permet de fixer les colorations sur certaines pièces histologiques et favorise les colorations électives. Nous pouvons ajouter que ce même permanganate réduit l'acide osmique; on peut trailer par ce moyen les coupes après les avoir fixées sur la lame au moyen du procédé connu de l’albumine coagulée par la chaleur; quand on a examiné ces coupes au microscope, et qu'on les a trouvées trop noires, on les lave à l’eau, puis au permanganale; elles ne tardent pas à s’éclaircir et à jaunir; si même on laisse la réduction se faire trop longtemps, les coupes deviennent complètement transparentes.

Le second liquide de fixation auquel j'ai eu souvent recours est le sublimé à chaud ou à froid, dissous à saturation dans l'eau, avec addition d’un peu d’acide acétique.

On emploie la solution suivante :

SUUUDAENCONON 1 een 5 gr.

Acide acétique cristallisable. . ..…. DAC MATE PM ON .—100gr.

Le sublimé est le mode de fixation qu'on emploie dans la méthode de Viallanes, et je dois dire quelques mots de cette méthode, parce qu’elle m'a rendu de très grands services. Elle m'a été obligeamment communiquée par M. de Nabias, qui l'a appliquée à l'étude de quelques types de Gastéropodes. C'est une méthode qui consiste à colorer les pièces in toto par l’hématoxyline, en se servant comme mordant du sulfate de cuivre. Voici les doses et la marche à suivre. Les pièces, après avoir été fixées par le sublimé à 5 p. 400 en solution aqueuse acidulée, et ensuite lavées à grande eau, sont traitées pendant vingt-quatre heures par une solution à 4 p. 400 de sulfate de cuivre; on les lave ensuite pendant six heures et on les colore pendant douze heures dans une solution récente d'hématoxyline ainsi composée :

Hématoxyline a ati ne aie eine € . O0 gr. 05 AICOUIMADSOINR rss eme coses MTS DC EL EE NP ET ABC, Ce

Puis, nouveau bain dans une solution de sulfate de cuivre à 4 p. 100, puis déshydratation par les alcools, ets. Cette méthode donne d'excellents résultats pour l'étude des fibres nerveuses et aussi pour l'étude des cellules. Je Pai appliquée à quelques Insectes, et surtout aux Crustacés (Astacus fluviatilis, Palinurus, Homarus, Oniscus, ete.).

Sous l'influence du sulfate de cuivre et de l’hématoxyline, les fibres nerveuses et le noyau des cellules prennent une belle coloration bleu vert foncé; le protoplasma des cellules prend une teinte plus pâle, d'un vert gris. J'ai observé qu'on a grand avantage à traiter les pièces par la safranine, après avoir fait les diverses réactions de la méthode de Viallanes; on obtient ainsi des doubles colorations qui sont fort instructives. La safranine se porte sur tous les points qui ont été faiblement teintés par l'hématoxyline. Ainsi, quand un ganglion à été traité par la méthode de Viallanes, puis coupé et fixé sur une lame de verre, si on le traite par la safranine, on voit d’abord les cellules conjonctives se colorer en rouge; on peut suspendre à ce moment l’action de la safranine et obtenir des coupes où seules les cellules conjonctives sont en rouge; si, au contraire, on laisse cette action se continuer, le protoplasma des cellules nerveuses se colore à son tour; il ne se colore pas in toto de la même manière; la coloration rouge apparaît d’abord dans les régions cen-

Ron

trales du protoplasma, celles qui entourent immédiatement le noyau : les régions périphériques gardent plus longtemps leur coloration bleu vert. En même temps, au milieu du noyau coloré en bleu vert, on voit apparaître de petits nucléoles colorés en rouge. Nous dirons plus loin quels avantages nous avons tirés de cette méthode des doubles colorations pour l'étude de la structure fibrillaire des cellules nerveuses.

On à préconisé dans ces dernières années de nouvelles méthodes pour l'étude du système nerveux des Invertébrés. La méthode de Golgi, sous la forme spéciale, dite intensive, imaginée par Ramon y Cajal, nous a donné des résultats si partiels, si peu constants que nous jugeons inutile d’en parler ici.

Une seconde méthode, qui a été souvent employée dans ces dernières années, est la méthode au bleu de méthylène (méthode d’Ehrlich); elle consiste soit à colorer au bleu de méthylène l'organe vivant, — el dans ce cas on fait l'injection du liquide dans la cavité générale du corps de l'animal, — soit à immerger l'organe disséqué dans une solution faible. C'est la méthode que Retzius a employée dans son étude sur l’Ecrevisse.

Les résultats donnés par cette méthode sont à peu près comparables à ceux que donne la méthode de Golgi; ils éclairent l'étude des prolongements cellulaires et des relations qui existent entre les différentes cellules. Au contraire, la méthode d'Ehrlich est impropre à l'étude de la structure fibrillaire du protoplasma; elle est donc loin de faire double emploi avec la méthode de Viallanes.

Ebrlich, en injectant du bleu de méthylène, mêlé à une solution physiologique de chlorure de sodium, dans des grenouilles vivantes, constata le premier que cette substance colore avec intensité les terminaisons nerveuses et spécialement les terminaisons sensitives : cette coloration, on ne peut l'obtenir sur le vivant ni avec la fuchsine, ni avec le violet de méthyle, ni avec la safranine. Ebrlich remarqua que la coloration par le bleu de méthylène se fait mieux quand la pièce reste exposée pendant quelque temps au contact de l'air, mieux aussi quand l'injection a lieu dans l'animal vivant; le bleu de méthylène ne se fixe sur les tissus en conservant sa couleur que dans le cas où il s'oxyde ; c’est pour ce motif que la coloration a besoin de se faire en contact avec l'air; si elle se fait dans un tissu à l'abri de l’air, la substance se réduit aussitôt, absorbe deux atomes d'hydrogène et donne un'produit incolore. Quand le tissu

est vivant, il contient une plus grande quantité d'oxygène que le tissu mort, et par conséquent il se colore mieux; dans certaines pièces dont la coloration est incomplète, le bleu ne se manifeste qu'à la périphérie, c’est-à-dire dans les parties les mieux exposées à l'air. Enfin Ehrlich a constaté que la réaction est favorisée par un milieu alcalin; si l’alcalinité des fibres nerveuses est faible, la coloration sera difficile.

Un grand nombre d'auteurs ont, nous l'avons vu dans l'historique, appliqué la méthode d'Ebrlich à des Invertébrés, et en ont modifié certaines parties. Dogiel a obtenu de bonnes colorations sur des pièces disséquées et exposées à l'air. Biedermann a favorisé l'oxydation des tissus en les plaçant dans une atmosphère imprégnée des vapeurs de térébenthine résinifiée; on sait que cette substance dégage de l’ozone. Enfin Retzius, aussitôt après avoir fait l'injection, qu’il dirigeait dans la région abdominale des Écrevisses, ouvrail l'abdomen en enlevant le tégument de la face ventrale, pour mettre la chaîne nerveuse en contact direct avec l'air; il attendait ensuite six heures et davantage avant d'examiner les pièces, ayant constaté que la coloration devient avec le temps plus élective et plus belle. Retzius employait des solutions de bleu de méthylène à 1 millième. Mme Rina Monti, dans un travail récent auquel nous avons emprunté quelques-uns des détails précédents, a fait usage d’une solution beaucoup plus concentrée.

Bleu de méthylène.......... rie CT ee 0 gr. 50 Chlorure de sodium. .... RE M Te 0,37 NUE AE RO TT DE RE PAR 50

L'inconvénient principal et très sérieux de la méthode d’Ehrlich est de ne pas donner des préparations permanentes. Quand la pièce colorée est soustraite à l’action de l'air, la réduction de la matière colorante ne tarde pas à se manifester et donne des produits incolores; c’est ce qui a lieu par le seul fait qu'on met la pièce à examiner sous une lamelle, pour l’étudier au microscope; on sait que la réduction continue également dans la glycérine et le baume. Les auteurs se sont efforcés de trouver un réactif fixant la matière colorante. On n'y est pas encore complètement parvenu; on a cependant trouvé quelques substances qui retardent la décoloration. La meilleure est le picrate d’ammoniaque. On place la pièce dans une solution saturée de picrate, on l’y laisse séjourner pendant un cer-

op tain temps, puis on la porte dans un mélange à parties égales de picrate et de glycérine, dans lequel on fait l'examen microscopique. Biedermann a indiqué un procédé utile pour empêcher que la coloration ne s’évanouisse avant le moment où le picrate d'ammoniaque pénètre au centre de la pièce; il place la pièce sur un petit coussinet de papier filtré, imbibé de picrate; le tout est conservé en chambre humide, de sorte que la pièce n'est pas soustraite au contact de l’air pendant la pénétration du picrate d'ammoniaque.