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A l'inspection de ces chiffres, on voit que les grandeurs des deux constantes 4, et 4", présentent des oscillations assez notables. Ces variations ne doivent pas être mises sur le compte de la méthode photométrique:; les erreurs possibles dans les déterminations des coefficients d’extinction w’auraient pas produit des oscillations aussi notables. Celles-ci proviennent probablement d’une détermination inexacte des valeurs de c. Comme dans tous les procédés optiques, la préparation du liquide à examiner est sujette à plus de causes d’erreur que l’analyse proprement dite.
En second lieu, je remarque que mes propres résultats présentent, en général, des oscillations beaucoup plus fortes que ceux de v. Noorden. J’attribue cette circonstance à la nature de l’instrument qui a servi à mes déterminations. En vertu même de son principe, il est moins exact que celui de Hüfner ; de plus, lè modèle que j’avais entre les mains présentait plus d’une défectuosité. Certaines pièces avaient une mobilité très préjudiciable à Pexactitude des déterminations.
L'erreur moyenne de chaque résultat est pour l’hémoglobine de cheval :
Ponant lies à 0,000059 DOUrMA UNE ip mentir, 0,000042
Pour. budget 0,000075 POUR etui 0,000048
Dans les expériences de v. Noorden, l’erreur moyenne de chaque résultat est :
POULE 0,000062 POURAS Em ee DR leur 0,000041
Il est évident que l’unique série de déterminations que j’ai faite avec de lhémoglobine de chien, n’est pas suffisante, et je considère ces résultats simplement comme une valeur approchée de A, et de A’,.
Les valeurs obtenues pour l’hémoglobine de cheval méritent plus de
confiance, puisque les déterminations sont plus nombreuses, et que l'erreur moyenne de chaque résultat est assez faible. Néanmoins, je me propose de vérifier ces expériences avec le spectrophotomètre de Hüfner.
Ce dernier a fixé, en outre, pour le sang de chien, la valeur des rapports d'absorption de l’hémoglobine dans les deux mêmes régions spectrales (1). Il a trouvé :
Enfin, d’après v. Noorden, les valeurs de A, et A’, seraient les suivantes, pour le sang de rat et celui de cochon d'Inde :
RARE ee me RE 0,001491 0,001105 Cochon d'INtOR EN 0,001395 0,001027
Les chiffres ainsi obtenus ne sont applicables en pratique que si l’on démontre au préalable : 1° qu’il n’existe pas, au point de vue optique, de différence entre une solution sanguine et une solution d’oxyhémoglobine cristallisée; 2° que le sang ne contient pas d’autres matières colorantes absorbant la lumière des mêmes régions du spectre.
On a vu plus haut, que lorsqu'une solution ne contient qu’une seule matière colorante, le rapport des coefficients d’extinction, dans deux régions spectrales, est constant et indépendant de la concentration. Il est facile de voir que ce rapport est égal au rapport inverse des valeurs de A dans les deux régions spectrales, puisqu'on a pour une solution de concentration donnée, c:
C "A CINE) d’où : ÂÀe — AÀ'e!
(4) Zeitsch. f. physiol. Chemie, I, p. 4, et IV, p. 35.
et : | ne
Or, Hüfner et v. Noorden ont trouvé chez le chien :
Pour des solutions sanguines ............ Fe = 1,33 Pour des solutions d’hémoglobine. ....... à = 01
En outre, des déterminations faites par v. Noorden, ont montré que le
quotient ia est sensiblement constant d’une espèce animale à l’autre, qu’il à 0 s’agisse de dilutions sanguines ou de solutions d’oxyhémoglobine cristallisée.
Voici la série des valeurs obtenues jusqu’ici :
A A", Espèces animales. Solutions sanguines. Solutions d’hémoglobine cristallisée.
Chiénss rie 1,330 1,324 Papas RS Arabes 1,327 1,349 Cochon d'Inde ..... 1,359 1,357 HODMS RSA — CHACRR EFRESSS 1,326 — HOMO Ne 1,320 — Moyennes... 1,330 1,343
Jai fait moi-même, avec le spectrophotomètre de Vierordt, quelques déterminations analogues, et j'ai trouvé dans les mêmes régions spectrales les valeurs suivantes :
Sangide chien." 1,35 MP IOUtON es eue che 1,36 OO) PO 1,36 = VOA re 1,35
Enfin, dans un travail récent, M. Branly est arrivé à des conclusions identiques, en se servant d’un spectrophotomètre à faisceaux polarisés à angle droit et superposés. « En introduisant deux sangs d’espèce différente dans les cuves prismatiques, on parvient à faire disparaître les franges dans la partie commune des deux spectres, par un déplacement convenable des deux cuves, et elles disparaissent dans toutes les couleurs à la fois ». M. Branly a constaté ce résultat avec les hémoglobines et sangs suivants :
Sang humain sain et à plusieurs états pathologiques ; Sang de bœuf ;
Sang de chien;
Hémoglobine de chien;
Sang de cheval ;
Hémoglobine de cheval ;
Sang de coq ;
Sang de carpe.
Il est donc permis d'admettre que toutes les hémoglobines possèdent le même noyau coloré, et que le noyau albuminoïde (1) seul varie d’une espèce animale à l’autre.
On a vu plus haut, que la concentration d’une solution sanguine s’obtient en multipliant son coefficient d'extinction e par le rapport d'absorption A, déterminé une fois pour toutes et pour la même région spectrale. L’exactitude du dosage dépend donc d’abord du degré de précision avec lequel on a fixé la valeur de cette constante. C’est actuellement là le point faible de la
(4) Voir page 13.
méthode spectrophotométrique, puisque les rapports d'absorption ne sont encore connus avec exactitude que pour le sang de chienetque leur détermination rencontrera, pour certaines hémoglobines, des difficultés faciles à prévoir. Néanmoins, on peut toujours exprimer la richesse relative des sangs analysés par les coefficients d’extinction, qu’il sera possible de transformer plus tard en poids absolus d’hémoglobine. C’est ainsi que Leichtenstern a fait sur l’homme un très grand nombre de dosages, dont les résultats sont exprimés par les coefficients d'extinction du sang dilué au 1/100, et examiné sous une épaisseur de 1 centimètre.
Mais supposons le rapport d'absorption de l’oxyhémoglobine déterminé avec une exactitude suffisante. L’erreur que comporte, dans ce cas, le dosage par voie spectrophotométrique, dépend évidemment du degré de précision avec lequel on mesure le coefficient d'extinction de la solution sanguine, c’est-à-dire l’intensité lumineuse restante. En donnant à l’une des fentes une largeur connue, égale, par exemple, à 100 divisions du tambour, puis s’exerçant à établir légalité d’éclairement des deux spectres, on trouve chaque fois, pour l’autre fente, une largeur qui diffère de 100 d’une grandeur représentant l’erreur commise. Je préfère indiquer directement ici les quantités d’hémoglobine fournies successivement par huit mesures photométriques, faites sur une même dilution au 1/200 d’un sang de bœuf et qu’on examine sous une épaisseur de un centimètre. La première colonne indique les intensités lumineuses restantes ; la seconde, les coefficients d’extinction correspondants ; la troisième, les poids d’hémoglobine pour 100 cent. cubes de sang, calculés en posant A', — 0,001, comme pour le sang de chien.
Moyenne. .... 13,07
L'erreur moyenne de chaque résultat est de 05,16 d’hémoglobine pour 100 cent. cubes de sang, ou de 1,31 pour 100 gr. de matière colorante. Mais elle devient plus forte si, au lieu de faire des lectures successives sur le même liquide sanguin, on prépare chaque fois une nouvelle dilution, car, à l'erreur de lecture, vient s’ajouter alors celle que comporte forcément la mensuration d’un liquide visqueux comme le sang, et dont les éléments figurés tendent sans cesse à se précipiter.
J’ai préparé successivement avec le même sang de bœuf quatorze dilutions, en ajoutant des quantités variables d’eau à 1 cent. cube de sang à analyser. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau suivant, dont la première colonne indique le volume de liquide auquel on a étendu chaque fois 1 cent.cube de sang ; la seconde, les intensités restantes après passage de la lumière à travers une épaisseur de 1 cent. cube de la solution sanguine; la troisième, les coefficients d'extinction correspondants ; la quatrième, les quantités d’hémoglobine pour 100 cent. cubes de sang, calculés en posant comme tout à l’heure A’, — 0,001.
Dilutions. li Ê k.
Moyenne..... 13 ,08
L’erreur moyenne de chaque résultat est cette fois de 0,28 pour 100 cent. cubes de sang, ou 2,25 pour 100 gr. d’hémoglobine. Parmi ces chiffres, quelques-uns concordent d’une facon remarquable ; d’autres, au contraire, présentent des écarts considérables que je rattache en grande partie à certaines défectuosités de l’appareiïl qui me servait, et sur lesquelles j’ai déjà insisté plus haut. Cependant, si l’on veut faire abstraction du septième et du dernier résultat, qui sont évidemment à rejeter, on voit que les autres présentent un accord remarquable, et que leur erreur moyenne est certainement très faible.
Le dosage de l’hémoglobine par voie spectrophotométrique, est donc susceptible d’une grande exactitude, mais à la condition d'observer rigoureusement certaines précautions que je vais résumer ici.
Il faut repérer avec soin la région spectrale dans laquelle on veut mesurer l'absorption, et maintenir un parallélisme exact entre les bords des écrans mobiles et ceux de la fente du collimateur. Il est bon de vérifier de temps
en temps, à l'aide du microscope, l'intégrité des vis micrométriques qui servent à mesurer les intensités lumineuses, en s’assurant qu’à une même indication de deux tambours, correspond réellement une égale largeur des deux fentes.
Il faut que l’œil de l’observateur soit placé bien en face de l’oculaire, de telle facon que l’on apercoive une hauteur égale des deux spectres, et déplacer la lunette oculaire jusqu’à ce que la ligne qui les sépare apparaisse nettement. En outre, pour une même indication des deux tambours, les deux spectres doivent être identiques, sinon il faut déplacer la lampe, afin qu’elle éclaire également les deux fentes.
Les liquides examinés doivent être absolument limpides, ainsi que les parois de la cuve et le cube en flint. Le moindre louche absorbe des quantités notables de lumière et fausse absolument les résultats.
Il est indispensable de choisir un éclairement tel que les intensités lumineuses ne soient pas trop fortes. La comparaison des deux spectres doit se faire rapidement en fermant et en ouvrant alternativement l’œil placé devant oculaire, après chaque déplacement de la vis. Si on fixe le champ lumineux même pendant un temps assez court, la rétine se fatigue et la sensibilité diminue aussitôt.
Les résultats ainsi obtenus sont-ils comparables à ceux que fournissent les autres procédés ? Comme mes déterminations ont presque toutes porté sur du sang de bœuf pour lequel le rapport d’absorption A’, n’est pas déterminé, il m'était difficile de transformer les coefficients d’extinction obtenus en poids d’hémoglobine exacts en valeur absolue. Si on adopte pour le sang de bœuf, le coefficient 0,001 trouvé par Hüfner pour l’oxyhémoglobine de chien, on trouve des résultats notablement inférieurs à ceux que fournit un dosage comparatif de fer. C’est ce qui ressort nettement du tableau suivant, dans lequel la première colonne indique les coefficients d’extinction d’une série de sangs de bœufs dilués au 1/200 ; la deuxième, les quantités d’hémoglobine p. 100 calculées à laide du rapport d’absorption A', — 0,001 et la troisième, les poids de matière colorante déterminés par dosage du fer, dans 100 cent. cubes de sang.
Les résultats fournis par le spectrophotomètre sont tous trop faibles, ce qui tient évidemment à une erreur par défaut du rapport d'absorption adopté.
Mais les résultats consignés dans ce tableau permettent decalculer au moins une valeur approchée de la constante d’absorption de l’hémoglobine du sang de bœuf. Il suffit, pour cela, de diviser la somme des coefficients d'extinction par la somme des poids d’hémoglobine contenus chaque fois dans un centimêtre cube du liquide examiné au spectroscope. Comme le sang a été dilué au 1/200, cette somme est égale à:
La somme des coefficients d'extinction est, d’autre part, 5,55137. On aura donc:
