MÉTHODES D'OBSERVATIONS

Avec un peu d'habitude on arrive assez facilement à dépouiller les cocons de leur coque chitineuse, à l’aide de deux petites aiguilles à cataracte. Toutefois il est bien rare que le contenu ne soit pas touché en un point par la pointe de l’aiguille ; ce qui d’ailleurs dans la plupart des cas ne présente aucun inconvénient. Si l’on désire avoir des embryons isolés, il faut fendre le cocon sous lacide acétique à 2/100 ; les cellules vitellines se séparent alors les unes des autres, et les embryons peuvent être puisés avec une pipette. Mais si l’on veut avoir le contenu entier d’un cocon, l’opération est plus délicate : et 1l faut opérer sous l’alcool à 60°; les cellules vitellines restent dans ce cas adhérantes les unes aux autres, par suite sans doute de la coagulation du liquide interposé. Le degré de l’alcool est ensuite graduellement remonté, et il est prudent de ne mettre la préparation dans les bains de colorants que plusieurs jours plus tard.

Quand on ne désire se procurer qu’un ou deux embryons d’un cocon ; on peut se contenter de couper le cocon en deux. Dans ce cas, un certain nombre d’embryons sont nécessairement coupés, mais on retrouve toujours dans l’un des deux hémisphères quelques embryons intacts. Étant pressé par le temps, j'ai employé un jour ce procédé barbare sur un Cocoon qui renfermait des embryons déjà allongés, et je ne fus pas peu surpris de voir que tous les embryons indistinctement étaient coupés par le milieu du corps. Ce fait indiquait avec évidence que les embryons devaient tous avoir une même orientation dans le cocon. Je n’ai pu déterminer cette orientation qu’en partie. Il faut pour cela prendre des cocons à embryons allongés, c’est-à-dire à

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partir du stade de la disparition du pharynx embryonnaire, et les ouvrir sous l’alcool, ou bien les soumettre à l’ébullilion avant de les ouvrir. On prend alors comme point de repère le point d'attache du cocon, qui se reconnaît toujours à la présence de la substance visqueuse qui sert à le fixer. Si l’on considère comme axe des pôles la ligne qui passe par le point d’attache et par le pôle opposé, on constate que les embryons sont disposés suivant les méridiens ; on comprend par suite qu’il n’est pas indifférent d'ouvrir le cocon par une sechon équatoriale ou par une section méridienne.

Les méthodes de préparations que j'ai suivies sont au nombre de trois. |

1° Préparations au carmin de Beale.

Ces préparations m'ont donné de bons résultats pour Pétude des cellules vitellines, et des phénomènes de la fécondation et de la karyokinèse. Les œufs segmentés ou non sont isolés de la majeure partie des cellules vitellines par l’action de l'acide acétique à 2/100, puis traités par le carmin de Beale. Seulement, comme les œufs et les blastomères des Dendrocæles d’eau douce ont une très grande affinité pour les matières colorantes, il est bon de n’employer qu'une liqueur carminée étendue. |

2° Préparations par eclatement.

C’est grâce à ce mode de préparations que j'ai pu me rendre compte de la disposition des blastomères dans les stades 4,8, 11. Le cocon étant ouvert sous l’acide acétique à 2/100, je laisse les cellules vitellines se dissocier, et Je puise avec une pipette les petits points blancs qu’on voit à la loupe et souvent même à l’œil nu. Ces points blancs sont des œufs environnés de leurs cellules vitellines rayonnantes. Je les porte isolément dans des verres de montre

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contenant de l’acide acétique à 2/100, afin de les débarrasser des cellules vitellines libres qui encombreraient la préparation. Après un ou deux lavages les œufs sont complètement isolés, on les met alors sur des.porte-objets séparés. L’œuf est alors examiné à un faible grossissement et, s’il est bien seul sur la lame de verre, on ajoute une goutte de liqueur de Beale ou de picro-carmin, et on couvre en donnant à la lamelle un très léger mouvement de glissement. Les cellules vitellines adhérantes se séparent alors presque toujours en deux parties, l’une qui reste adhérante à l’œuf, et l’autre au contraire qui s’en sépare en le mettant en évidence. Dans la plupart des figures qui représentent ces préparations par éclatement, je n’ai représenté que les cellules vitellines adhérantes, quelquefois même je ne les ai pas représentées du tout afin de simplifier le travail du graveur. J’ai voulu cependant faire reproduire en entier une de ces préparations (PI. III, fig. 32), afin de montrer que ce procédé n’a rien de barbare, quand on a pris soin de bien isoler l’œuf de toutes les cellules vitellines qui ne lui adhèrent pas, mais qu’au contraire il donne des résultats tellement nets que je crois être en droit d’affirmer que la présence des globules polaires n’aurait pas pu m échapper, si ces corps existaient réellement.

3° Méthode des coupes.

C’est celle que j'ai le plus employée, et c’est la seule possible à partir du moment où les cellules vitellines commencent à diffluer.

La fixation à l’aide de l’acide osmique simple ou carminé * donne de bons résultats, à la condition de ne laisser agir ces réactifs que pendant quelques secondes et de bien laver la préparation ensuite. C’est même le seul moyen quand on veut étudier les globules réfringents des cellules vitellines, globules qu’on retrouve dans la masse nutritive de l’embryon. Cependant je n’ai pu employer ce réactif qu’avec

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une extrème réserve, à cause de la sensibilité particulière de mes yeux aux vapeurs de l’acide osmique. D’ailleurs cet acide n’est pas très favorable pour l’étude des cellules embryonnaires, à cause de l’opacité qu’il donne aux préparations et de l'obstacle qu’il met à la pénétration des colorants.

L'alcool fixe très bien les embryons qu’on peut alors colorer avec la plus grande facilité en employant des teintures alcooliques. Le carmin picro-boraté alcoolique réussit très bien, ainsi que le lilas alcoolique ou carmin boraté alcoolique, et Ja plupart des colorants aujourd’hui employés. Toutes mes inclusions ont été faites dans la paraffine et mes préparations montées dans le baume. Enfin j'ai presque toujours donné une épaisseur de 10 x à mes coupes.