TECHNIQUES D'OBSERVATION DE LA MALADIE

Pour suivre l'évolution de la maladie, on ne peut guère recourir à l'examen clinique de l'animal, à la courbe de poids ou de température ; le seul signe constant est la constatation d’hématies parasitées dans le sang. Ces dernières peuvent être mises en évidence par deux procédés : examen microscopique, inoculation du sang étudié à une souris ou à un rat neufs.

a) Examen microscopique du sang. — La lecture du frottis sanguin permet d'établir le pourcentage d’hématozoaires ou de globules rouges parasités pour 100. La numération, à l'hémaiimètre de Malassez, du nombre d'hématies par millimètre cube permet de déduire le chiffre absolu par millimètre cube des GRP présents dans le sang. La critique que nous avons faite ailleurs de ces méthodes [29] montre que la numération des parasites par millimètre euhe, méthode à priori la plus sûre, est en fait difficile et sujette à de nombreuses causes d'erreurs ; en pratique, la recherche du pourcentage des globules rouges parasités donne aisément un reflet fidèle de l'importance de la parasitémie.

b) Inoculation à un animal neuf : Rat et surtout Souris. Cette technique n'est utile que lorsque la parasitémie est très faible, trop peu importante pour être décelée à l'examen d'un frottis de sang : seul alors le passage à l'animal réceptif révèle Ja présence d'hématozoaire.

3. TECHNIQUES D'EXPLORATION DE L'IMMUNITÉ, Les techniques que nous avons emplovées sont les suivantes:

a) Coloralion et numération des réticulocytes. — Les réticulocytes, ou hématies à substance granulo-réticulo-filamenteuse, sont mis en évidence par coloration vitale avec le bleu crésyl brillant. C'est le procédé classique que nous avons modifié pour conserver les préparations et obtenir sur la même lame la coloration simultanée des hématies granulo-filamenteuses et des plasmodies. Pour cette coloration combinée, nous utilisons la technique suivante : une goutte de sang est mélangée sur lame avec une goutte d’eau citratée à 2 p. 100 additionnée de bleu crésvl brillant ; après une minute, étalement et dessication du frottis ; puis fixation et coloration avec les colorants de May Grundwald et Giemsa. Cette lame permet de savoir la proportion d’hématozoaires respectivement présents dans les rétieulocytes et dans les globules rouges mûrs, et le pourcentage de

rase

réticuloeytes pour 100 hématies. Le calcul du nombre absolu des réticulocytes se fait aisément à partir du nombre absolu des globules rouges par mn, compté à la cellule de Malassez.

Rappelons que les hématies polychromatophiles, mises en évidence par fixation à l'alcool et coloration panoptique, sont aussi des hématies jeunes mais que la substance basophile est diffuse dans tout le stroma globulaire et lui donne une teinte plus ou moins violacée, tandis que les colorations vitales ou post-vitales montrent cette substance sous l'aspect réticulofilamenteux : les hématies polychromatophiles sont done des réticulocytes, mais un certain nombre de globules rouges jeunes ne contiennent que trop peu de substance basophile pour apparaître polÿvchromatophiles sur un frottis coloré au Giemsa, tandis que seule la coloration vitale les révélant comme réticulocytes montre qu'il s’agit d'hématies immatures. Il est donc préférable pour étudier le taux de ces hématies et leur parasitisme, d'étudier la réticulocvtose sanguine plutôt que de se contenter d'apprécier la polychromatophilie.

b) Réinoculation avec des quantités connues et massives de globules rouges parasités. — On emploie des quantités de sang contenant 300 millions ou plus de globules rouges parasités pour un.animal de 120 grammes et au-dessus ; chez le petit rat de 50 grammes, une dose de 30 millions de globules rouges parasités est suffisante. Le sang de l’animal donneur dont la parasitémie est connue et assez forte (au moins 10 p. 100 de préférence) est prélevé par ponction cardiaque et recueilli dans un volume égal d’eau citratée à 2 p. 100. Une numération à l’hématimètre de Malassez permet de déterminer la quantité de globules rouges parasités contenue dans un centimètre cube de ce mélange sang-eau citratée. Ce dernier est injecté, en quantité voulue, dans la cavité péritonéale ou dans les cavités cardiaques.

Si l’inoculat est introduit dans le péritoine, c'est à partir de la troisième heure que l'on peut déceler en quantités suffisantes sur le frottis l'apparition de globules rouges parasités dans le sang périphérique ; mais on peut parfois les mettre en évidence une demi-heure ou une heure après l'injection. En cas de recours à la voie intracardiaque, les parasites sont visibles dès les premièrés minutes.

Comme G. Faprant et R. VarGues l’ont montré [31] lorsque le sang infestant provient d'un animal au stade IT ou TIT, les hématozoaires se trouvent dans de grosses hématies à protoplasme bleu violet et sont plusieurs par hématies ; il est facile alors, lorsqu'elles apparaissent dans le sang du rat receveur, de

les distinguer des globules rouges du receveur qui sont de taille normale et de teinte rosée par coloration au Giemsa.

Il est à noter que l’inoculation intracardiaque est assez délicate : dans un nombre de cas relativement fréquent, il y a constitution d’un hémopéricarde mortel. L’injection intrapéritonéale äu contraire n'offre aucune difficulté ni inconvénient, aussi est-elle employée comme une technique de routine.

Le passage plus ou moins important dans la circulation générale des hématies parasitées introduites dans le péritoine, la multiplication des parasites, la durée et le taux de cette parasitémie permettent d'apprécier le degré plus ou moins grand d’immunité acquise.

c) Test de séro-protection. — Il consiste à tester le pouvoir protecteur du sérum d’un animal immun (c'est-à-dire guéri de primo-infection paludéenne) ou hyperimmun (dont l’immunité a été renforcée par de nouvelles réinoculations d’hématozoaires après guérison). Dans ce but, on injecte le sérum dans la cavité péritonéale d’un animal neuf que l’on impalude une heure plus tard par injection intrapéritonéale de globules rouges parasités et dont on suit l’évolution de la parasitémie par des examens sanguins quotidiens ou biquotidiens. Nous verrons plus loin que la technique qui nous a donné les meilleurs résultats consiste à employer de petits rats de 50 grammes, à injecter le sérum que l'on veut éprouver à la dose de 1 ce. (il est difficile d'obtenir des quantités plus grandes sans risquer de tuer le rat par saignée) et à injecter une heure plus tard 30 millions de globules

rouges parasités.

d) Test périlonéal. — Pour étudier le destin des globules rouges parasités introduits dans la séreuse péritonéale et la réaction cellulaire provoquée par cette inoculation, nous avons eu recours à la technique suivante : injecter dans la cavité péritonéale du sang citraté contenant une quantité importante d'hématozotaires ; à des intervalles de temps variables, ponctionner la cavité péritonéale au moyen d'une aiguille de 8/10 à biseau court en aspirant avec une seringue (pour cette opér'ation, il est préférable de maintenir l'animal en position ventrale) : retirer ainsi une quantité de sérosité suffisante pour faire un étalement sur lame, qui est coloré au May-Grünwald Giemsa. Après 24 heures, l'aspiration par la seringue ne ramenant plus de liquide, faire une laparatomie médiane, sous anesthésie à l'éther, et aspirer à la pipette Pasteur une quantité suffisante de sérosité pour exécuter un frottis.

DRFON TES