CHAPITRE" II

Etude de la vitesse de décoloration

En 1884, GrAM rend un service immense à la Bactériologie en montrant que les Bactéries fixées puis successivement traitées par le violet de gentiane, la solution de Lugol, et l’alcool, peuvent se diviser en deux catégories, les unes restant colorées en violet ou violet noir, les autres au contraire se décolorant complètement. Lorsqu'on utilise une coloration de contraste telle que l’éosine ou la solution aqueuse de fuchsine, on constate que certaines plastides restent violettes et les autres roses, et pendant très longtemps, on admit en Bactériologie que les microorganismes « prenaient ou ne prenaient pas le Gram » suivant qu'ils restaient colorés en violet noir ou se teintaient en rose.

Au bout d’un certain temps, on se rendit compte que ces subdivisions étaient tout à fait arbitraires et bientôt NEIDE (1904), A. Meyer (1912), PALGEN (1925), Lasseur et SCHMITT (1927), Coupray (1929), Bacx et DELÉTANG (1931), Lasseur, A. Dupaix et MacGurtror (1931), A. Du- PAIX (1933), virent la nécessité de substituer à la notion de « prend ou ne prend pas le Gram » celle de « durée » ou de « vitesse de décoloration ».

On sait que le pouvoir tinctorial de certaines solutions colorantes est considérablement augmenté par la présence de phénol (acide phénique). Mais oh sait aussi que l’addition de phénol diminue considérablement la stabilité des solutions. Les solutions de violet notamment présentent instantanément une louche ou un trouble qui fait place à la formation de petits flocons se déposant au fond du récipient et sur ses parois. Or, si l’on traite deux préparations provenant d’une même culture microbienne, l’une avec la solution fraichement préparée, l’autre avec la solution âgée de plusieurs mois, on constate que bien souvent la Bactérie qui aurait dû « prendre le Gram » se décolore sous l’action de l'alcool.

Aussi, il n’est pas rare de trouver dans la littérature afférente aux espèces microbiennes, des contradictions en ce qui concerne la méthode de Gram. Les facteurs de stabilité des solutions colorantes sont nombreux. De très bonne heure, les Bactériologistes cherchèrent à augmenter le pouvoir tinctorial des solutions de violet de gentiane par l'addition d’aniline, puis on s’aperçut que cette dernière pouvait être remplacée avantageusement par le phénol, dont nous avons signalé plus haut l’action sur ce colorant.

Les Microbiologistes s’efforcèrent de stabiliser les solutions de violet de gentiane, et pour cela ils firent appel à des faits qui avaient été observés dans l'étude des solutions colloïdales. Les métaux, à l’état micellaire, ne résistaient pas longtemps à l’action précipitante du temps, et Zsvc- MONDI (1) avait stabilisé des suspensions d’or et d'argent en déposant à la surface de la phase dispersée un film de gélatine.

Les Bactériologistes réussirent, à l’aide d’apports de gélatine en proportion convenable, à retarder la précipitation du colorant. Mais les solutions ainsi stabilisées ne conservaient leur pouvoir tinctorial que quelques semaines ou quelques mois.

Nous avons vu que le phénol, s’il augmente le pouvoir tinctorial des solutions colorantes, diminue malheureusement dans des proportions considérables la stabilité des solutions de violet. Les choses en étaient là lorsque BouraRIC décrivit un fait vraiment curieux et bien inattendu.

Nul n’ignore combien le célèbre physicien dijonais a travaillé avec le Professeur ACHARD, et de ce fait, s’est longuement familiarisé avec les phénomènes biologiques. BoUTARIC avait donc remarqué que les suspensions colloïdales avaient une durée éphémère et, après d’autres auteurs, il déplora l’action précipitante d’un ion déterminé pour une solution donnée. Il tenta alors de réaliser dans les solutions colloïdales des phénomènes rappelant la vaccination. Il démontra, en effet, expérimentalement « la protection qu'exerce l'addition d’un électrolyte en quantité très faible contre la floculation produite par des doses plus fortes du même électrolyte » (1931).

LassEuUr et ses Collaborateurs, mettant à profit la découverte de Bou- TARIC, Sont arrivés à préparer des solutions stables de colorants en combinant l’action du phénol et celle de la gélatine. J'indique ci-dessous le

(1) ZsYGMoNDr appelle « indice d'or, le nombre de milligrammes de colloïde protecteur exactement nécessaire pour empêcher le Virage au violet de 10 cmS de solution d'or rouge vif » (Coupray, 1929, thèse de Pharmacie, Faculté de Nancy, p. 72).

tableau d'apport du phénol à la solution de violet qui figure dans la thèse de A. Duparx, à la page 61.

La solution colorante définitive est constituée par :

Solution alcoolique de colorant à 10 %......... 50 cm° Solunonndé séltinenm 02708 Tes En, 200 cm° Soltion d'acide phéniquela Hat een. 250 cm°

On ajoute lentement à la solution de colorant à 10 %, les 200 cm° de solution de gelatine. Le mélange est mis à l’étuve à 37° C. durant 24 heures. Les doses croissantes d'acide phénique sont additionnées à la solution hydroalcoolique gelatinisée, dans l’ordre suivant:

1° jour: 0,05 cm° de la solution phéniquée à 5 %,. 20m 0,10 "cm — SAPIDUTRS AU 50 CN — 4 jour: 1 cm — Soupe tbe. en — Cour OC — Lalout 22p mcm - SAJOUTLN ON RICE —= Séjour 002% em — 10° jour: 108,35 cm° —

Total : 250 "cm

On laisse 4 jours au repos, puis on filtre.

Muni d’une solution qui me permettait d'opérer toujours dans les mêémes conditions d'expérience, j’ai alors déterminé la vitesse de décoloration dans la méthode de Gram des trois types dissociés de Bacillus lactis niger Gorinr. Les résultats sont consignés dans le tableau ci-après et 3 graphiques permettent au Lecteur de se représenter les différences de vitesses de décoloration entre ces trois types.

La technique employée pour l'obtention de cultures pures, pour la mise en suspension des plastides bactériennes, pour l’étalement de ces suspensions sur les lames porte-objets est la même que celle employec pour la mesure des dimensions des germes dans le chapitre précédent.

Les temps d’action des différentes solutions sont les suivantes :

Violet de gentiane : Z minutes ; Lugol (première série de vases de Borrel): 30 secondes ; Lugol (deuxième série): 1 minute 30;

Alcool: 5, 10, 20, 40 et 60 minutes :

Eau distillée: 1 minute;

Fuchsine de Gram: 45 secondes :

Eau distillée pour lavage des préparations : 2 minutes.