CARACTÉRISATION CHIMIQUE

D’après ce que nous venons de voir dans le chapitre précédent, il ressort qu’une forte quantité de l’hémoglobine injectée est retenue par l'organisme. Nous avons cherché à localiser d’une façon aussi précise que possible ce pigment. Ne pouvant déterminer chimiquement ses différents produits de dégradation, nous nous sommes bornés à doser le fer dans les divers organes, en nous basant sur le fait que l’hémoglobine, ainsi que beaucoup de ses dérivés, sont des composés ferrugineux. Mais le problème est ici fort complexe du fait de la présence de ce métal, d’une part dans l’hémoglobine des hématies sanguines, et d’autre part, dans chaque tissu en tant que constituant normal. Or, le degré d'irrigation sanguine d’un tissu est variable et la quantité d’hémoglobine contenue dans le sang étant par ailleurs très élevée, aussi nous avons pensé que les dosages de fer effectués sur des organes non débarrassés de leur sang n'auraient pas grande signification, la valeur de l'augmentation possible de ia teneur en fer après l’injection d’hémoglobine pouvant être nettement inférieure aux variations normales de la teneur en fer moyenne d’un animal à l’autre.

Nous nous sommes astreints à réaliser, avant tout dosage, l'élimination aussi complète que possible de toutes les hématies contenues dans le système circulatoire par

lavage convenable et de l’animal entier, et de chaque organe ensuite séparément.

Avant d'opérer chez des animaux traités par l’hémoglobine, nous nous sommes attachés à déterminer, bien entendu, la concentration moyenne en fer des divers organes ainsi lavés chez des chiens normaux.

Ces deux points ainsi établis, nous avons effectué alors nos recherches chez des chiens ayant reçu préalablement une solution d’hémoglobine dans les veines. Nos prélèvements furent faits immédiatement après la cessation de l’hémoglobinurie.

1° Méthode employée pour éliminer le sang

dans les organes.

La méthode que nous avons utilisée est dérivée en fait de celle de Whipple pour la détermination du volume sanguin des animaux. Nous avons opéré de la façon suivante. Le chien, qu’il ait été ou non traité antérieurement par une solution d’hémoglobine, est opéré sous anesthésie au chloralose. On sectionne la trachée, et on adapte à celle-ci une canule trachéale mise en communication avec un appareil à respiration artificielle dont les constantes ont été réglées auparavant en fonction du poids et du rythme respiratoire de l’animal.

Aussitôt cet appareil est mis en fonctionnement. On dénude et on ouvre ensuite les deux veines jugulaires. On adapte alors à l’intérieur d’une veine fémorale, préalablement isolée, une grosse aiguille par laquelle arrive du liquide de Ringer Locke citraté et réchauffé à 38°. Ce liquide est contenu dans plusieurs barillets gradués, d’une capacité unitaire de dix litres, reliés entre eux en parallèles, et placés à environ un mètre au-dessus du niveau de la veine fémorale du chien, de manière à créer une pression supplémentaire d’un dixième d’atmosphère. Le liquide s’écoulant de ces récipients, passe dans un échan-

geur de température, plonge dans un thermostat chauffé à 42°. La partie distale de cet échangeur se termine par un tube de caoutchouc épais qui le relie à l’aiguille intraveineuse. Un thermomètre, intercalé dans le circuit à la sortie du thermostat, indique à chaque instant la température du liquide réchauffé. Les constantes de l’appareil sont telles qu’en régime normal de circulation le liquide sortant de l'échangeur est exactement à 40°. La déperdi- Uon calorifique mesurée une fois pour toute avec le tube en caoutchouc, reliant l’échangeur à la veine du chien, étant de 2°, le liquide de Ringer arrive donc dans la veine à la température exacte et constante de 38°.

Au bout d’un certain temps de perfusion, on met l’animal en position de Trédelenbourg. Le sang sortant des veines est collecté dans des récipients où il est soigneusement mesuré. On connaît donc à chaque instant le volume éliminé et le volume introduit.

Dans les premiers instants, c’est uniquement du sang pur qui s’écoule des jugulaires, puis, peu à peu, le liquide s’éclairicit et, au bout d’une demi-heure environ, il devient couleur carotte. I} faut, pour obtenir ce résultat, faire passer dans l’organisme cinq litres de liquide de perfusion. IT est bon d’ajouter à celui-ci du citrate de soude, faute de quoi des caillots peuvent se former dans la circulation et entraver la perfusion.

Dès la première heure, on constate que le volume du liquide éliminé est inférieur à celui du liquide injecté. Cette différence semble s’établir assez rapidement et progressivement et se fixer ensuite régulièrement à une valeur d’un litre environ pour un chien d’une vingtaine de kilogrammes.

Dans les expériences où il remplaçait intégralement le sang d'animaux par du liquide de Ringer Locke hémoglobiné, Amberson et ses collaborateurs se sont heurtés au même phénomène; les conditions expérimentales dans lesquelles ils opéraient étaient pourtant meilleures que les

nôtres, puisqu'ils injectaient un liquide à pression colloiä“ale osmotique importante, ce qui ne les exposaient pas, comme dans le cas de notre solution saline, à la formation d'œdème. Les auteurs craignant cependant qu’une telle rétention dans l’organisme entraînât des troubles respiratoires et circulatoires, établirent un synchronisme rigoureux entre les volumes de liquide qu'ils injectaient et les volumes de liquide qu’ils enlevaient. Nous n’avions pas à tenir compte de tels faits dans nos expériences, puisque nos animaux étaient destinés à être sacrifiés immédiatement.

Au bout de trente à quarante minutes, le chien meurt. Mais la respiration artificielle assure par la suite un brassage constant et rythmique des organes médiastinaux et abdomniaux qui facilite de ce fait la circulation liquidienne.

Le liquide sortant des jugulaires devient de moins en moins teinté; et il arrive un moment où, sous une faible épaisseur, il semble rigoureusement incolore, mais la centrifugation y dénote toujours la présence d’un faible mais net culot d’hématies. Notons d’ailleurs que le liquide surnageant reste clair, ce qui indique qu'aucune hémolyse ne se produit.

Le lavage se poursuit, et cependant, d’un examen à l’autre du culot de centrifugation du liquide recueilli aux jugulaires, on constate que la faible quantité d’hématies qu’il contenait ne diminue plus sensiblement. Amberson et ses collaborateurs ont, en effet, montré que chez les chiens splénectomisés la courbe de décroissance du volume des hématies est géométrique, du type exponentiel, et de raison trois quarts, tandis que chez les chiens normaux, cette courbe n’est pas régulière. On observe vers la fin de l’expérience un «plateau splénique » durant lequel le nombre des globules rouges reste constant, parce que les réserves de la rate sont régulièrement déversées dans la circulation. Il faudrait très longtemps pour arriver à les épuiser.

C'est ainsi que, dans un cas, nous avons prolongé la perfusion pendant neuf heures, sans obtenir au bout de ce temps de meilleurs résultats qu’au bout de quatre heures. Il n’y a donc pas intérêt à attendre, et, dans la pratique, nous n’avons en général réalisé la perfusion de tout le corps que pendant trois heures, utilisant à cet effet de quinze à vingt litres de liquide de Ringer Locke.

Le chien est alors autopsié. On prélève dans les cavités thoraciques et abdominales les diverses viscères une à une, en repérant soigneusement leurs vaisseaux afférents et efférents. Ces viscères sont déjà à peu près exsangues et ne présentent de faibles colorations sanguines que sur des plages plus ou moins étendues. Le moins bien irrigué est naturellement la rate. On dénude alors l'artère ou les artères de chaque organe (pour le foie, en plus, la veine porto), on introduit dans la lumière de ces vaisseaux, aiguilles ou canules de calibre correspondant, et on les y fixe solidement par ligature externe. Par l’intermédiaire de ces aiguilles ou canules, on adapte alors le système circulatoire de ces différents organes en batterie, à des bonbonnes contenant du liquide de Ringer Locke et sous une dénivellation d’un mètre vingt environ. On laisse ainsi les viscères se laver jusqu’à ce qu’ils soient organoleptiquement décolorés et que le liquide sortant des vaisseaux efférents ne contienne plus trace d’hématies après centrifugation. Le temps nécessaire varie de deux à quatre heures, selon l’organe. Les plus difficiles à déglobuliniser sont les reins et la rate. Pour le foie et le poumon, la chose est au contraire fort aisée. Les organes étant ainsi lavés, on les sectionne et on les immerge pendant douze heures dans de grands bassins remplis d’eau distillée afin de parfaire leur nettoyage.

La technique précédente étant difficilement applicable aux cas du muscle et du cerveau, nous avons réalisé leur perfusion sur place de la façon suivante :

Des aiguilles adaptées dans les deux carotides et les

deux artères vertébrales sur le cadavre, dont le cou est complètement sectionné à sa base, permet d’irriguer toute la tête. On prolonge cette irrigation pendant plusieurs heures, et quand le liquide de sortie est privé d’hématies, on prélève le cerveau et le muscle masseter, puis, après section, on les immerge comme ci-dessus dans l’eau pendant douze heures. Même en opérant ainsi, le cerveau se lave mal. On constate toujours la présence à sa surface, sous les méninges, de vaisseaux sanguins, contenant encore un peu de sang coagulé. Cette partie est enlevée soigneusement.

Après douze heures d'immersion dans l’eau des divers organes, on effectue un dernier lavage à eau courante, et

on procède ensuite aux manipulations nécessaires aux dosages.

2° Technique utilisée pour le dosage du fer.

Les techniques de dosage du fer auxquelles nous pouvions avoir recours sont nombreuses, citons les méthodes suivantes :

La méthode de Nicloux et Welter, qui est une microméthode pondérale, basée sur l’hydrogénation de l’oxyde ferrique;

La méthode de Kujelmas, basée sur la coloration rouge du sulfocyanate ferrique et sa solubilité dans l'alcool isoamylique;

La méthode de Fontès et Thivolle, ou méthode molybdomanganimétrique, qui met à profit, après la réduction du sel ferrique en sel ferreux au moyen du cuivre métallique et à chaud, l'intensité de la coloration bleue que donne ce sel en présence de réactif phosphomolybdique et la disparition ultérieure de cette coloration par oxydation au moyen d’une solution titrée de MnO“K;

La méthode de Zizine à l’alloxanthine:

La méthode de Knecht et Hibhert au chlorure de titane,

employée également par Henriques et Roques, et reposant sur la réduction quantitative au moyen du chlorure de titane des sels ferriques en sels ferreux avec le rhodonate de K. comme indicateur de fer IIT;

La méthode de Fleury et Marque, qui consiste, après incinération au four à moufle de la matière à détruire, en présence de nitrate de Mg, à reprendre les cendres par de l’acide chlorhydrique, à réduire tout le sel ferrique par le mercure et à oxyder enfin le sel ferreux ainsi obtenu par le réactif phosphomolybdique de Fontes et Thivolle, avec formation corrélative de bleu de molybdène, qui, ensuite, est oxydé quantitativement par une solution de MnO‘K N/400;

La méthode étudiée par Elvehjem et Hart, Lintz, Hanzal, Hill et Farrar, qui consiste, après destruction au four électrique de la matière organique, en présence de COCa (afin d'éviter la volatilisation du chlorure ferrique), à reprendre ces cendres par de l’acide chlorhydrique, oxyder par de l’acide azotique, ajouter du thiocyanate de K. et de l’alcoo!l isoamylique, et comparer la coloration rouge ainsi obtenue à une solution titrée en sel ferrique traitée dans les mêmes conditions;

La méthode de Lavollay qui, après incinération en présence d'acide azotique, reprend les cendres par de l’acide chlorhydrique. Le fer contenu dans cette solution est précipité en milieu acétique à un pH de 5 par de la 8-hydroxyquinoléine. Si le précipité est important, on le pèse, si non, on le dissout dans l’alcool et l’on compare colorimétriquement la coloration vert-noir obtenue.

La méthode de Drilhon, basée sur la formation de ferrocyanure ferrique, par action du ferrocyanure de K. sur une solution ferrique suffisamment diluée pour qu'aucun précipité ne se forme. L’auteur utilise la destruction nitroperchlorique de Lemate, Boinot et Kahane, avec reprise par CIH et comparaison avec un étalon.

Enfin, nous citerons une dernière méthode, une des plus

sensibles utilisée ces derniers temps pour la détermination du fer sérique. C’est celle dont le principe est dû à Hill, et qui est basée sur l'intensité de la coloration rose développée par l’&-« dipyridyl en présence d’ion ferreux. Mais récemment Heilmeyer proposa de remplacer ce corps par un autre indicateur plus sensible et plus stable, l’orthophénantroline. Cette coloration est d’ordre beaucoup trop faible pour qu'avec de faibles quantités de fer, la comparaison puisse être établie par l'œil humain, aussi le dosage est-il effectué avec le Stephen photomètre de Pulfrich en lumière monochromatique verte. Par cette technique, on arrive à doser quelques y de fer p. 100. Cette méthode fut en particulier étudiée par Lederer Moesschalk, Van Goidsenhoven et Hoet.

Si nous considérons la plupart de ces méthodes, nous constatons qu'après destruction de la matière organique, les cendres sont la plupart du temps reprises par de l’acide chlorhydrique pur. Or, MM. les Professeurs Denigès et Chelle avaient eu leur attention déjà attirée par l’intensité de la coloration jaune que communiquaient des traces de fer à de l’acide chlorhydrique concentré. Nous avons cherché en conséquence à obtenir s’il ne serait pas possible d'établir un dosage colorimétrique basé sur une telle réaction. Après quelques recherches, nous avons finalement abouti à une méthode très simple et suffisamment sensible qui comprend essentiellement deux parties : minéralisation de la substance organique et reprise par l’acide chlorhydrique pur, comparaison colorimétrique de cette solution avec une solution titrée de fer dans de l’acide chlorhydrique.

a) Destruction de la matière organique. — Chaque organe est découpé en minces lanières. On effectue sur une fraction de cet organe la détermination de l’humidité selon les conditions habituelles. D’autre part, on prélève un poids exact, compris entre quatre et cinq grammes, que

l’on dispose dans les capsules en quartz de dix centimètres de long et de 1 cm. 5 de large. Ces capsules sont placées dans un four à moufle, chauffé aux environs de 100°. La substance se dessèche. On augmente alors progressivement la température de façon à obtenir une lente décomposition pyrogénée que l’on prolonge aussi longtemps que nécessaire, à forte température, jusqu’à ce que l’on obtienne une masse charbonneuse friable, exempte de toute masse liquide noirâtre. La durée totale de l’opération est d'environ une heure et demie.

Lorsque la décomposition pyrogénée est obtenue, on place la nacelle dans un four électrique parcouru par un léger courant d'air ou, mieux encore, par un courant d'oxygène. Ce four a été préalablement étaloné thermométriquement, dans les mêmes conditions, au moyen d’un couple thermo-électrique. On a déterminé ainsi des courbes d’échauffement en fonction, d’une part, du temps, et, d'autre part, de l'intensité du courant. Des courbes furent établies pour des intensités de 5; 45; 4; 3,5; 3 et 2,5 ampères, en pointant toutes les cinq minutes la température du four. On effectua aussi dans les mêmes conditions des courbes de refroidissement pour les différentes températures.

On peut ainsi connaître, sans couple thermo-électrique, uniquement en fonction du temps de chauffe et de l’'ampérage fourni, la température à laquelle on opère à chaque instant. Nous avons choisi, après de nombreux essais, la température de 650° comme température optima. Au-dessous de cette température, la combustion s’éternise: audessus, on peut obtenir une déperdition de fer sous forme de silicates fusibles.

La capsule est poussée progressivement vers la partie la plus chaude. Le carbone s’enflamme et brûle sous l’influence du léger courant d’air aspiré par une trompe à eau. On laisse ainsi l’incinération se poursuivre jusqu’à obtention de cendres blanches. Le temps nécessaire varie

d’un organe à l’autre. II est d’environ une demi-heure seulement pour le poumon, de deux heures environ pour la rate, le cœur, le muscle.

Quand l’incinération est terminée, on retire la nacelle: on la laisse refroidir; on ajoute quelques gouttes d’acide chlorhydrique rigoureusement pur sur les cendres; et on laisse en contact environ dix minutes. Ceci fait, on pratique le dosage proprement dit du fer.

b) Dosage colorimétrique du fer. — Nous rappelons que le principe de ce dosage est basé sur la coloration très intense du chlorure ferrique en solution dans lPacide chlorhydrique concentré.

L’acide chlorhydrique contenu dans la capsule est décanté dans un matras jaugé de 10 ou 20 cc. selon la teneur approximative en fer. On complète ce volume avec l'acide chlorhydrique de lavage. On centrifuge pour obtenir un liquide rigoureusement clair. On prélève 5 ce. de ce centrifugat que l’on place dans un tube à essai de diamètre convenable. Cet échantillon est comparé colorimétriquement aux tubes d’une gamme étalon obtenue par dilution convenable avec de l’acide chlorhydrique pur d’une solution mère à 1 p. 1.000 de fer dans de l’acide chlorhydrique. Ces tubes étalons correspondent à une concentration respective de 1, 2, 3, 4, 5, etc., milligrammes de fer par litre.

On peut ainsi doser des quantités très faibles de fer. Par exemple, si l’échantillon à examiner correspond à létalon 4, la quantité de fer contenue dans les 20 cc. de la solution chlorhydrique est égale à huit centièmes de milligramme. Les meilleures lectures s’effectuent entre les étalons 4 et 10. Pour des doses supérieures, la coloration est trop intense; on ramène alors entre ces limites par dilution convenable. Si on s’attend à une concentration inférieure à 4 milligrammes p. 100, on complète dans le premier temps à 10 cc. seulement.

Nous avons effectué pour beaucoup de nos essais des dosages en double et en triple. Les résultats obtenus ont toujours été très comparables. Des quantités théoriques de fer additionnées à du blanc d’œuf et traitées dans les mêmes conditions que précédemment, furent retrouvées avec une erreur maxima de 5 p. 100.

Il semble donc que ce soit une méthode pratique, aisée, rapide et suffisamment sensible.

3° Résultats obtenus.

Les conditions générales d'administration de l’hémoglobine ont été les mêmes dans ces recherches qu’au cours de tout notre travail. Les animaux subirent d’abord un prélèvement de sang de 30 cc. par kilogramme de poids du corps, puis on leur fit une injection intraveineuse en vingt à trente minutes, d’une quantité moitié moindre d’une solution d’hémoglobine de cheval à 6,5 p. 100, rendue isotonique au plasma sanguin de chien, de même composition minérale que ce dernier milieu, et filtrée sur filtre Seitz stérilisant.

Nous avons ainsi traité quatre chiens en vue du dosage du fer dans leur tissu. Aucun des animaux n’a présenté de troubles appréciables dans le fonctionnement de leur rein, en dehors de l’hémoglobinurie. Le lavage et le prélèvement de leurs viscères furent faits le lendemain du jour où cessa l'élimination de l’hémoglobine par les urines, et alors que ce pigment n’existait plus dans le plasma. Nous sommes donc en droit de penser que tout le pigment retenu dans l’organisme était alors fixé dans les divers organes, et il n’était pas illogique d’admettre qu’à ce moment, ceuxci n'avaient pas encore eu le temps de les détruire ou de les éliminer. Les examens histologiques que nous avons rapportés et sur lesquels nous reviendrons plus loin sont d’ailleurs en confirmation avec cette manière de voir.

Nous avons par ailleurs fait des dosages de fer dans les

mêmes tissus de trois chiens témoins, parfaitement normaux.

L'ensemble de nos résultats se trouve groupé dans le tableau ci-joint.

TABLEAU DES RÉSULTATS OBTENUS POUR LES DOSAGES DE FER DANS LES ORGANES DE CHIENS NORMAUX ET DANS CEUX DE CHIENS ANTÉRIEU- REMENT HÉMOGLOBINÉS, CES DERNIERS, AYANT ÉTÉ SACRIFIÉS LE LENDEMAIN DE LA CESSATION DE L'HÉMOGLOBINURIE.

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