DOSAGE DE LA CHOLESTERINE DANS LE SERUM ET DANS LES TISSUS

a) Procédé pondéral.

Je commence par ce procédé bien que ce soit le moins employé. Plus difficile que le procédé colorimétrique, il demande beaucoup plus de temps. Par contre, cette méthode est beaucoup plus précise et peut servir pour doser à la fois la cholestérine du sérum et la cholestérine des tissus.

La technique que je vais exposée est entièrement définie par GRIGAUT.

Dans un ballon de 250 centimètres cubes, on place 20 centimètres cubes de sérum sanguin, 20 cmc. de lessive de soude à 36° Baumé (100 gr. de soude par litre) ; on porte le tout à l’autociave pendant une heure.

Dans le cas des tissus, on mélange 5 à 10 grammes de tissus frais avec 40 cmc. de lessive de soude diluée au 1/2 de manière à reproduire les conditions précédentes.

Le liquide sortant du bain marie est introduit dans une ampoule à décantation et agité lorsqu'il est encore chaud (40-45°) avec 60 centimètres cubes d’éther; dix

Etre

secondes suffisent. Lorsque les liquides se sont séparés, on soutire entièrement la couche aqueuse inférieure dans le ballon de 250 centimètres cubes et, après l’avoir ramené à la température de 40-45° on procède à une seconde extraction de la même manière que précédemment.

Les liqueurs éthérées, évaporées dans une capsule en porcelaine laissent un résidu formé par la totalité de la cholestérine à laquelle se mêlent quelques impuretés. Afin de les éloigner, le résidu est dissous dans 50 centimètres cubes d’alcool à 95°, additionnés de 1 centimètre cube de soude alcoolique à 1 pour 100. On évapore le mélange au bain-marie, on porte à l’étuve à 100° pendant une demi-heure, puis on épuise le résidu à l’éther de pétrole que l’on verse dans la capsule encore chaude.

Par le repos, la masse des impuretés se dépose, laissant une liqueur étherée limpide que l’on filtre sur amiante. On lave soigneusement la capsule et l’entonnoir à l’éther de pétrole et on abandonne les solutions éthérées réunies, à l’évaporation spontanée dans un petit cristallisoir taré. La cholestérine se sépare à l’état de pureté sous formes de longues aiguilles blanches et soyeuses.

Il reste à procéder à la pesée, après dessication du produit à l’étuve à 100° jusqu’à poids constant.

La pureté du résidu final est contrôlée par le fait qu’il présente les constantes physiques de la cholestérine à savoir :

Point de fusion : 145-148°.

[a]n —— 36°61 en solution chloroformique.

LADA

Cette méthode donne le chiffre de la cholestérine totale exprimée en cholestérine libre sans rien présumer de l’état libre ou de combinaison initial.

Normalement par cette méthode le taux de cholestérine trouvé est compris entre 1 gr. 40 - 1 gr. 90 par litre, on peut considérer que 1 gr. 60 donne la cholestérinémie normale.

b) Procédé colorimétrique de Grigaut.

Ce procédé est d’une exécution plus facile et moins longue que le précédent. Il est aussi moins exact.

Si l’on traite le sérum par une solution éthéroalcoolique alcaline, toute la cholesthérine du sérum passe dans la couche éthérée. Sur l’extrait éthéré repris par le chloroforme on pratique la réaction de Liebermann (coloration verte par l’action de l’anhydride acétique et de l’acide sulfurique). La teinte obtenue se prête facilement au dosage colorimétrique.

On opère sur le sérum et non sur le sang, car si les globules à l’état normal contiennent la même quantité de cholestérine que le sérum, il n’en est plus de même pour les cas pathologiques, les variations portant presque exclusivement sur le sérum. Le sérum contient de la cholestérine sous 2 formes : libre 20 à 25 % et éthérifiée (éther oléique et palmitique). Le procédé de GrIGAUT dose la cholestérine totale.

Voici la technique telle qu’elle est donnée aux travaux pratiques de Chimie biologique à la Faculté de Pharmacie de Paris (Thèse de Briant, 1930).

1e Extraction.

Dans une ampoule à décantation de 60 centimètres cubes (cholestérimètre de GRIGAUT) introduire dans l’ordre suivant en mélangeant après chaque addition :

SAC SE dr PRES 2 cmc. (à la pipette).

Alcool sSOdé ME Er A 13 cmc. (à l’éprouvette). Ether sulfurique du com-

Mer Ce LM TRUE 15 cmc.

Teinture de cochenille .... II goutes.

Laisser reposer 10 minutes. Soutirer la couche inférieure qui est colorée en rose. La remplacer par 20 centimètres cubes d’eau distillée (auquel on peut facultativement ajouter 2 à 3 cmc. de solution saturée de sulfate de soude) que l’on fait couler le long des parois. Après 5 minutes de repos, soutirer et procéder de la même façon à un nouveau lavage.

Après séparation complète des eaux de lavage, l’éther est versé dans une capsule ou un cristallisoir. Laver le cholestérimètre 2 fois avec 2 à 3 cme. d’éther à chaque fois et verser cet éther dans la capsule. Evaporer au bain-marie à siccité (souvent après l’évaporation de l’éther qui se fait très rapidement il reste un peu d’eau dans la capsule dont il faut faciliter lévaporation en chauffant doucement).

2° Réaction de Liebermann.

Le résidu est repris par 2 cme. de chloroforme du

() Alcool à 60° contenant 0 gr. 60 de soude. On peut obtenir ce réactif en mélangeant :

Lessivedetsondet a 36%#Baumeées, RTE Ce CE 1 cmc. 25 AÏCOGI LA TIGE ET RS RE en DE EEE 62 cme. 5

EAU -LISÉILÉE DIRES TN EMEA Q. S. 100 cmc.

LE RRQ UNE

commerce est versé dans une éprouvette graduée de 15 cme. (tubes à essai gradués fournis par la maison Poulenc avec le cholestérimètre) on rince la capsule à l’aide de chloroforme (par portion de 1 cmc.) que l’on verse dans l’éprouvette de façon à parfaire 5 cme.

On y ajoute 2 cmc. d’anhydride acétique pur et 5 gouttes normales d’acide sulfurique.

Laisser reposer une demi-heure.

En même temps on prépare un étalon colorimétrique, en mélangeant de la même manière, dans un tube à essai gradué de 15 cmc. (analogue au précédent), 5 cmc. de solution chloroformique de cholestérine à 0,06 gr. pour 100, 2 cmc. d’anhydride acétique et 5 gouttes de SO*H? comptées avec le même comptegouttes.

Au bout d’une demi-heure au moins et de 3/4 d'heure au plus, on compare le tube étalon avec la solution à doser introduite dans un tube à essai de même calibre. |

3° Mesure colorimétrique.

On compare la couleur verte des deux tubes sur un fond éclairé. Si elles sont égales, cela veut dire que les 2 cmc. de sérum contiennent la même quantité de cholestérine que celle introduite dans l’étalon c’est-à-dire 3 milligrammes (soit 1 gr. 50 par litre). Si les deux teintes sont inégales, on dilue la solution la plus colorée jusqu’à égalité de teinte. On utilise pour cela une solution constituée par 50 cmc. de chloroforme, 20 cmc. d’anhydride acétique et L gouttes d’acide sulfurique, que l’on verse à l’aide d’une burette graduée.

SRE E durs

4 Calcul.

Premier cas. — On dilue la solution à doser (le sérum contient donc plus de 1 gr. 50 de cholestérine par litre) à l'égalité de teinte, le volume de la solution à doser est devenu 7-+N les concentrations des 2 solutions sont égales puisque les deux teintes sont égales ce qui peut s’écrire de la façon suivante :

ee d'où x 7 7LN 2

ou x—(71N) X 0,214.

Deuxième cas. — On dilue la solution étalon (le sérum contient donc moins de 1 gr. 50 de cholestérine par litre).

A l’égalité de teinte, le volume de la solution étalon est devenu 7+-n, sa concentration ne correspond donc

1,50 1,50 plus à mais à et celle-ci égale celle de la 7 7+n < solution à doser représentée par — 1,50 x On écrira donc : = — 7+n 7 1,50X7 10,50 d’où x : = ——— 7+n 7+n Remarque I. — Pour obtenir des résultats exacts il

faut : 1° mettre exactement la même quantité d’acide sulfurique dans les 2 essais; 2° fixer la comparaison à un moment compris entre 1/2 heure et 3/4 d’heure après l’addition sulfurique.

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D pes 3 HV EN

Remarque II. — Cette méthode donne une approximation que l’auteur estime à 5 %, suffisante pour les variations à observer.

Il existe des réactions chimiques très sensibles qui peuvent servir pour caractériser la cholestérine fixée. On peut déceler la cholestérine dans les plaques blanches rétiniennes.

Ces réactions sont :

1° La réaction de Liebermann que nous connaissons déjà et que l’on obtient en mélangeant dans un tube

à essai :

Extrait chloroformique du tissu ...... 5 Cme. Anhydride acétique pur ...... nr LÉ CONC ACIHCSEUTITUÉ DUAL TTL NE HE IT gouttes.

Il se développe une coloration bleue passant peu à peu au vert.

2° La réaction de Salkowski.

Dans un tube à essai on verse successivement quelques centimètres cubes de l’extrait chloroformique du tissu et un volume égal d’acide sulfurique additionné de 1/10 de son volume d’eau, c’est-à-dire formé de 9 cmc. d'acide sulfurique pur et de 1 cmc. d’eau.

Le chloroforme se colore en rouge sang (en employant de l’acide SO*H? pur on constate que l’eau est nécessaire).

Enfin l’examen microscopique d’un tissu contenant de la cholestérine montre des paquets de cristaux en tablettes « en marche d’escalier » offrant l’aspect classique de la cholestérine. Au microscope polari-