II. — TECHNIQUE EXPÉRIMENTALE
Le sang de cheval, préalablement défîbriné, est centrifugé. Les globules, débarrassés du sérum par décantation, sont lavés une partie avec une solution de saccharose 70 0/0 et le reste avec une solution de NaCl 8 0/0, centrifugés, puis lavés une deuxième fois avec les mêmes solutions et de nouveau centrifugés. La purée de globules recueillie sert pour les expériences. Dans la plupart des cas, j'emploie une
emulsion de globules à \0 0/0, c'est-à-dire contenant 40 c. c. de la purée de globules émulsionnée dans 90 c. c. de la solution isotonique de saccharose ou de Na(U.
Le sérum dont j'étudie l'action dans une 2* partie de ce travail est celui qui a été prélevé par décantation après la centrifugation du sang de cheval défibriné.
L'acide acétique a toujours été employé en solution demi-normale.
Toutes les expériences ont été faites à température constante dans un thermostat £i eau réglé à 25*.
L'émulsion de globules est amenée à la température du thermostat avant d'être mélangée avec l'acide acétique ou le sérum, porté lui aussi à 25*.
Le moment du mélange est noté, puis, après des intervalles de temps déterminés, 8 à iO c. c. du mélange sont prélevés, placés dans des tubes & centrifugation et centrifugés immédiatement.
La centrifugation dure iO minutes. Le temps indiqué dans les expériences est celui qui s'écoule entre le moment où l'on fait le mélange et celui où l'on met en marche la centrifuge.
La quantité d'hémoglobine contenue dans le liquide surnageant est dosée au colori mètre et on peut en déduire la proportion de globules hémolyses.
Les séries qui sont comparées entre elles sont toujours faites le même jour, à la même heure et dans des conditions identiques. Mais on peut remarquer qu'en général, on obtient des résultats du même ordre de grandeur pour des séries faites à plusieurs jours d'intervalle et par conséquent avec des sangs différents.
III. — Étude de l'hémolyse des globules de cheval par l'acide acétique
/" Influence du milieu, — Il était intéressant de savoir si les globules se comportent de la même façon vis-à-vis de l'acide acétique lorsqu'ils sont lavt^s et émulsionnés avec la solution de saccharose 70 0/0 ou avec la solution de NaCl 8 0/0. Voici les résultats de cette comparaison :
a) Les globules lavés et émulsionnés dans la saccharose sont, pour les mêmes doses d'acide, beaucoup plus fortement hémolyses que ceux lavés et émulsionnés dans NaCI.
b) Le rapport entre la quantité de globules hémolyses dans l'un et l'autre cas n'est pas un rapport constant.
Des exemples numériques sont donnés plus loin.
2° Influence de la quantité d'acide, — La quantité de globules hémolyses croit avec la quantité d'acide, mais, pour les fortes doses surtout^ elle augmente plus rapidement que la quantité d'acide.
Les nombres suivants, qui indiquent les proportions de globules hémolyses, permettent de se rendre compte en même temps de l'influence du milieu et de celle de la quantité d'acide :
31 janvier 1906.
Saccharose.
iNaCI.
15 min. 70 min.
15 min. 70mîn.
1« 30 ce. émula, glob.
iO»/o + lg«-CH»C00Hl/2n..
nulle
nulle
traces
traces
ti aces
traces
Remarque. — On voit d'après les chiffres de ce tableau que pour les doses un peu fortes d'acide^ l'hémolyse est exactement la même après 70 minutes qu'après i5 minutes; pour des quantités moindres d'acide, il y a une différence^ mais elle est peu considérable. On peut donc en conclure que la quantité de globules susceptible d'être hémolysée par une quantité donnée de CH' COOII l'est presque complètement dès les premières minutes; aussi dans la plupart des expériences qui suivent, je me suis contentée de faire une prise après un temps d'hémolyse variant en général de i5 à 80 minutes.
5" Influence de la quantité de globules, — Si en laissant la quantité d'acide fixe, le volume total, restant constant, en fait varier la concentration en globules^ on remarque que pour des doses faibles d'acide, l'hémolyse est à peu près la môme dans tous les tubes, tandis que pour des quantités d'acide plus considérables rhémolyse est beaucoup plus forte dans 4es tubes où la concentration en globules est la plus faillie: Mais, dans ce dernier cas, l'augmenlalion de l'hémolyse n'est pas proportionnelle à la diminution de la concentration, c'est-à-dire que si la concentration est par exemple 4 fois plus faible dans une 1" série que dans une î2'"% l'hémolyse n'est pas 4 fois plus forte, mais seulement environ 2 fois plus forte.
Voici quelques nombres qui indiquent les quantités absolues de globules hemolyses pour des concentrations de globules de 20 0/0, iO 0/0, 5 0/0. Les chiffrer comparables se trouvent placés sur une même ligne horizontale.
Les globules ont été lavés au NaCl 8 0/0.
16 mars 1906.
L*hémolyse a duré 30 miautt^s.
17 mars 1906.
L'hémolyse a duré 13 minutes.
20 •/. iO »/. 5 «/•
!• 20 ce. émuls. glob. + 2 g"" CH'COOH 1/2 n 5. 4
1« 20 ce. émuls. glob. -|- 2g*»- CH»COOH 1/2 n 6.6
Ce résultat diffère de celui obtenu par Mlle Cernovodeanu et M. Victor Henri pour l'hémolyse par les serums ; ces auteurs avaient, en effet, trouvé que la vitesse initiale d'hémolyse produite par les hémolysines contenues dans les serums normaux est indépendante de la quantité de globules.
4" Addition fractionnée de globules et de NaCl. — Cette expérience permet d'analyser l'action de l'acide et son mode de fixation sur les globules : lorsque tout l'acide sera fixé sur les globules, l'addition soit de globules, soit de NaCl, devra avoir la même influence sur la marche de l'hémolyse. Après avoir effectué le mélange d'émulsion de globules et d'acide, j'ajoute à des intervalles de temps déterminés des quantités d'émulsion de globules ou de solution de NaCl 8 0/0, telles que le volume total soit le même dans tous les cas, afin d'avoir des mesures comparables.
On constate ainsi qu'après 5 minutes on obtient la même quantité de globules hémolyses, que Ton ajoute des globules ou du NaCl : on peut donc en conclure que Taeide se fixe sur les globules pendant les 5 premières minutes de contact.
C'est ce que montrent les chiiïres suivants qui indiquent les quantités absolues de globules hémolyses dans chacun des cas.
27 avril 1906.
La durée totale de l'hémolyse a été do 23 minutes.
!• 30 c.c.em. gL 10 •/• + *g"" CIPCOOI! 1/2 n 7.1
2» 15 — — 4- — + 10 sec. ap. ISc.c. em. gl. 10«/o. 7
3» 15 — — + — + - 15 — NaCl i7,5
4» 15 — — 4- — + 5 min. ap. 15 — em. gl 15,6
5« 15 — — + — + — 15 — NaCI 16,6
6*» 15 — — + — -f- lOmin.ap. 15 — em. gl lf>.9
7«15 — •— + — + — 15 — NaCI 18
8» 5 — — 4- — 4- ^<> sec. ap. 25 — em. gl 11.7
9«5— — + — -f.-.f5 — NaCl 15.3
10» 5 — — 4- — + 5 min. ap. 23 — em. gl 17,2
11" 5 - ^ + — + - 23 - NaCl 15.8
12» 5 — — + — + 10 min. ap. 23 — em. gl 17.8
130 5 — — + — 4- — 25 — NaCl 15.8
Il est bon de remarquer que toutes mes expériences étant faites à 25*, c'est pour celte température seulement qu'a été déterminée la vitesse d'absorption de Tacide par les globules.
5" Méthode de centrifagation. — Un autre procédé pour arriver à démontrer l'absorption de l'acide parles globules consiste à laisser les globules pendant un certain temps en contact avec l'acide, à centrifuger, à prélever une certaine quantité du liquide de centrifugation et à le mettre en contact avec de nouveaux globules.
On a dosé la quantité d'hémoglobine libérée pendant la impartie de l'expérience. Si cette quantité d'hémoglobine ne varie pas après qu'on a mis le liquide en présence de nouveaux globules, c'est que ces deuxièmes globules n'ont pas subi d'hémolyse ; on peut donc en conclure que tout l'acide avait été fixé par les premières globules.
On constate ainsi que l'acide est absorbé par les globules pendant les 5 premières minutes qui suivent le mélange.
Exemples : 5 juillet 1906.
Dans les séries I, H, III, IV, les globules sont restés 5 minutes en contact avor Tacide, on a centrifugé et mis en présence pendant 10 minutes les nouveaux globules et le liquide de centrifugation. Les nombres indiquent les quanlilés d'iiénioglobine contenues dans chacun dos liquides :
I. 30 ce. éimils. glob. 10 •/« -f 3 g'""» CIPCOOH 1/2 n Traces.
