I. — Historique
La Cytochimie photométrique a pour objet la détermination des quantités de certaines substances (acides nucléiques, protéines par exemple) contenues - dans une cellule individuelle ou un quelconque élément cellulaire. Elle permet l'analyse sous le microscope d’un noyau ou d’un chromosome /n situ. Elle utilise un dispositif spécial permettant de mesurer la quantité d'énergie lumineuse absorbée spécifiquement par un matériel déterminé.
On sait d’après les lois de Brer-LamBerr sur l'absorption, que cette quantité d'énergie lumineuse absorbée est fonction du nombre de molécules du matériel absorbant placé sur le trajet de la lumière. La cytochimie photométrique rend possible un véritable dosage à l'échelle de la cellule et permet d'aborder des problèmes que ni la chimie, ni la cytologie ne pouvaient résoudre.
On doit à CasperssonN d’avoir mis au point le premier, en 1936 (47-48), une élégante technique de photométrie. Utilisant le fait découvert par Duëéré (94-95), que les acides nucléiques absorbent spécifiquement la lumière ultra- violette dans la longueur d’onde de 2 600 À, et les protéines à 2 800 À, il put mesurer, par exemple, la quantité d'acide nucléique contenue dans une petite portion de cellule choisie sous le microscope en mesurant l'absorption de la lumière ultra-violette par la région envisagée. C'était la première fois que l’on réussissait à étudier quantitativement la répartition et les variations d’une substance chimique dans le cytoplasme d'une cellule ou sur un chromosome. Mais cette belle technique devait demeurer l’apanage de l’école suédoise car l'emploi de l’ultra-violet rendait l’usage de cette méthode extrêmement délicat et mal approprié à un travail de routine.
C'est pourquoi d’autres auteurs se sont préoccupés de mettre au point une technique plus simple utilisant la lumière visible et son absorption par un colorant approprié ; la spécificité de l’absorption de telle ou telle substance provenant, non de ses propres constituauts, mais de la nature du colorant fixé électivement sur la substance à étudier. Ce problème théoriquement facile à résoudre se compliquait singulièrement du fait que l’on ne connaissait guère de colorant véritablement spécifique. Nous verrons cependant que la réaction de FEULGEN (106), utilisée dans des conditions bien précises, semble à l'heure actuelle représenter une coloration très spécifique de l’acide désoxyribonucléique.
L'appareil décrit en 1947 par Pozzisrer et Ris (195) puis en 1949 par Pozrsrer et Moses (194) permet de mesurer l'absorption de la lumière visible par le complexe formé par une substance à étudier et un colorant spécifique. C'est
Eine
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une technique très simple et qui, nous le verrons, permet d'obtenir des résultats très intéressants.
Un autre appareil, inspiré dans son principe de celui de Porzisrer, fut construit récemment en Belgique par Lison (1438).
Nous envisagerons tout d’abord l'étude de la cytochimie photométrique dans le visible et son application au problème de l'ADN des noyaux, pour aborder ensuite la photométrie en lumière ultra-violette et l'emploi que nous en avons fait pour l'étude de ce même problème.
Il nous a paru que la convergence de trois méthodes très différentes : chimie, cytochimie photométrique dans le visible et photométrie dans l'ultraviolet devait, si elle était réalisée, être la meilleure réponse à toutes les objections que pouvaient susciter nos premiers résultats. Cette question de la constance de l’ADN dans le noyau cellulaire est d’une importance si fondamentale en elle-même et par ses développements lointains, qu’il n’est pas trop de recourir à toutes les techniques possibles pour l’établir avec une absolue certitude.
Il. — Cytochimie photométrique dans le visible. 1) DESCRIPTION DE LA TECHNIQUE DE POLLISTER
L'appareil mis au point par Pozuister, Ris et Moses (194-195) est extrèmement simple; il comprend un microscope que l’on munit des accessoires photométriques. Le schéma ci-contre représente les différents éléments de l'appareil.
Un banc d'optique porte le système d’éclairage comprenant une lampe à filament de 6 volts, une lentille, un diaphragme et un filtre Farrand qui isole la région spectrale utilisée. Ce filtre est placé dans un faisceau de rayons légèrement convergents comme dans l’appareil de Künzer, Le miroir du microscope est avantageusement remplacé par un prisme à réflexion totale. Le faisceau de lumière filtrée (557 my) issu de la source est réfléchi par le prisme, traverse la préparation, l’objectif et l’oculaire. Un système récepteur est disposé sur le microscope. Il comprend, d’une part, un oculaire gros- : sissant muni d'un micromètre placé au-dessus d’un diaphragme et, d’autre part, une cellule photoélectrique (phototube). Ces deux éléments peuvent glisser de telle sorte que l’oculaire et le phototube peuvent être successivement placés en face du faisceau provenant de l'objectif.
Pour effectuer une mesure, on amène un noyau au centre du champ et on ferme le diaphragme de façon à éliminer toute image sauf celle du noyau ; on peut alors mesurer le diamètre du noyau grâce au micromètre. On déplace ensuite l'oculaire et on le remplace au-dessus du diaphragme par la cellule photoélectrique. L'appareil est construit de telle sorte que l’image toute entière est reçue sur la cathode photo-sensible. On lit l’intensité I sur le galvanomètre relié à la cellule. On déplace alors la préparation pour avoir une plage exempte de noyaux dans le champ et on fait une deuxième lecture |,. Le rapport [/1, donne la transmission de la lumière T. Cette grandeur est
Es
L'ACIDE DÉSOXYRIBONUCLÉIQUE DES CELLULES ANIMALES 37 PR RSS ET ES SR TR
inversement proportionnelle au nombre des molécules absorbant la lumière, elle décroît suivant une courbe logarithmique lorsque le nombre de molécules absorbantes croît. On définit l'extinction E comme l'inverse du log. de J log.T E est donc directement proportionnelle à la concentration des molécules et à l'épaisseur de la couche absorbante, tout au moins lorsque la loi de Beer
la transmission E —
k AMPLIFICATEUR OCULAIRE PHOTOTURE
\ CGALVANOMETRE
