DISCUSSION

Nous avons vu que la technique de photométrie dans le visible repose sur l'absorption de la lumière par la substance à étudier combinée à tel ou tel colorant. Lorsque l’on a affaire à l'acide désoxyribonucléique, ilne s agit pas à proprement parler d’une coloration, mais en réalité d’une véritable réaction chimique faisant apparaître un complexe coloré ; nous voulons parler de la

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réaction de FEuLGEN (106) Cette réaction est à la base même de la méthode d'analyse photométrique dans le visible appliquée à l’acide désoxyribonucléique, c'est pourquoi nous nous intéresserons tout particulièrement à elle et lui consacrerons un assez long développement.

Nous étudierons successivement le principe de cette réaction et ce qu’on sait de son mécanisme chimique. Et puisque nous envisageons son emploi en cytochimie quantitative nous examinerons tour à tour les différentes qualités qu’elle doit alors présenter, à savoir que :

1) la réaction doit être spécifique,

2) la réaction colorée doit se produire au lieu même où est localisé l'ADN,

3) l'intensité de la coloration enfin doit être proportionnelle à la quantité d'ADN présent.

a) La réaction de FEULGEN et son mécanisme chimique. — Examinons plus en détail le mécanisme chimique de cette réaction qui se fait, rappelons-le, en deux temps. 1) Une hydrolyse acide du tissu, 2) une réaction de recoloration du réactif de Sanirr.

— En ce qui concerne l’hydrolyse, Ossorne et Heyz en 1908 (186) ont découvert que le traitement de l’acide nucléique par une solution d’acide sulfurique à 2 0/0 détachait spécifiquement et quantitativement les bases puriques, laissant en place les bases pyrimidiques. Ainsi, l’hydrolyse douce, éliminant les bases puriques, libère les groupes aldéhydiques du sucre lié à ces bases, c’est en ce point que résiderait la spécificité de la réaction.

— La réaction de coloration intervenant ensuite se produirait donc entre les groupements aldéhydiques ainsi démasqués, et le réactif de Sonirr. Au cours de cette réaction se synthétiserait ainsi un nouveau composé coloré. D'après Sracey et collaborateurs (1946) (226), le sucre donnerait par hydrolyse principalement de l’aldéhyde w-hydroxy lævulinique qui recolorerait la fuchsine réduite.

Sur le plan histologique, cette réaction a été longuement étudiée par Bauer (1932-1933) (9-10). Cet auteur a montré que le réactif de Scmirr employé sans hydrolyse préalable peut colorer les tissus et en particulier le cytoplasme des cellules. C’est la réaction dite « plasmale » (due à certains polysaccharides et aussi à des lipides). Mais précisons immédiatement que cette réaction plasmale ne saurait être une objection à la spécificité de la réaction nucléale si l’on prend soin de faire systématiquement une préparation de contrôle sans hydrolyse et de vérifier que cette préparation ne développe aucune couleur avec le réactif de Scmrr. Cette précaution prise, le Feulgen reprend toute sa valeur spécifique.

Bauer (9) a étudié en outre les variations de l’intensité de la réaction colorée de FEuLGEN avec différents temps d'hydrolyse. Il a constaté (et Hizvary l’a confirmé) (118) que l’intensité de la coloration croissait avec la durée de l’hydrolyse pour atteindre un maximum après lequel la coloration devenait moins forte.

b) Spécificité de la réaction de FeuLGen. — Depuis les travaux fondamentaux de FeurGex et de Bauer, cette technique a été utilisée par un très grand nombre de cytologistes et considérée comme une réaction très spécifique de l'ADN du noyau.

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L'ACIDE DÉSOXYRIBONUCLÉIQUE DES CELLULES ANIMALES 39 Le LES Em AT BR CN LP CRE

Lison (147) la considère comme une « réaction histochimique de grande valeur ». Cependant elle a été dès l’origine l’objet de nombreuses critiques ; les auteurs avaient dans certains cas des colorations constamment négatives ou bien des colorations aberrantes. D’après FeuLGEN et RosseNBEcx euxmêmes, il n’y aurait pas d’acide thymonucléique dans les levures et les bactéries. Or les dosages chimiques ont montré que ces microorganismes contenaient constamment de l'ADN (250-251), et des études de cytologie ont même prouvé l'existence d’un noyau figuré (177-205-242-243). Le fait que la réaction de FeuLG&en est difficile (mais non impossible) à réaliser sur ce matériel, et qu’elle donne des résultats souvent inconstants, doit être imputé probablement à la petite dimension du noyau à mettre en évidence (1). Il en est de même chez les Protistes où on a trouvé des résultats très discordants quant à la réaction de FeuLGen. Lison pense qu’il s’agit là d'erreurs techniques. On peut aussi penser que dans certains cas, la coque qui protège la bâctérie ou la levure par exemple, a pour effet de rendre difficile la coloration de FEULGEN.

Récemment encore, cette technique a été dans son principe l’objet de certaines attaques assez graves pour que nous les examinions ici :

En 1943, Srepmann et SrEDMAnN (230) ont nié formellement la spécificité de la technique de FeuL&ex. Ils pensaient que le colorant formé lors de la réaction entre leucofuchsine et acide désoxyribonucléique est diffusible et surcolore secondairement une protéine acide fortement basophile présente dans la chromatine : la chromosomine (231). D’après eux, l'ADN ne serait même pas un constituant des chromosomes, il pourrait être normalement diffus dans le suc nucléaire. Cette vue assez révolutionnaire est incompatible avec les résultats de CasPersson (52) qui avait déjà établi de façon incontestable, par l’emploi de l’ultra-violet, la localisation de l'ADN sur les chromosomes. Elle a été vivement critiquée par CaLzLan (43), Serra (214) et enfin Bracner (36). Ces auteurs s'appuient surtout sur le fait que la réaction de FeuLGEx devient négative lorsque l’on a traité une préparation par la désoxyribonucléase, et que d’autre part, la basophilie de la chromatine disparaît après l’action de cet enzyme, alors que celle du cytoplasme subsiste. Ce qui suggère, évidemment, que la colorabilité de la chromatine est bien due à la présence de l’acide désoxyribonucléique.

Enfin, le processus de la réaction a été soigneusement suivi par Di STe- PHANO (98-99) qui a retrouvé les résultats de Bauer et montré que là coloration de FEULGEN est maximum pour un temps d’hydrolyse de 12 minutes. Le processus de diffusion ne se manifeste que pour des temps plus longs : on constate alors que la coloration décroît, tandis que les molécules d'ADN se scindent en molécules plus petites (acide thymique et ses produits de dégradation) qui deviennent solubles. Ainsi, le processus de solubilisation et de diffusion invoqué par les Srepmann, n'intervient pas dans la technique de FEuLGEN, quand elle est effectuée dans les conditions classiques. Il ne se produit qu’au cours d’une hydrolyse trop prolongée. Il semble donc bien admis

(t) DELAMATER (89) a récemment publié la technique qu'il emploie pour mettre régulièremeut et facilement en évidence le noyau de la levure. Il utilise à cet effet un mordançage préalable au formol.

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à l’heure actuelle que la technique de FeuLGen représente un test cytochimique de grande valeur tout à fait spécifique de l’acide désoxyribonucléique.

c) Utilisation de la réaction de FeuLGEN pour la détermination quantitative de l’acide désoxyribonucléique. — Le moment est venu de voir maintenant si on peut légitimement utiliser cette réaction de FEULGEN pour une estimation quantitative de l’acide désoxyribonucléique et d'examiner les études qui ont été poursuivies dans ce sens.

Il y a bien longtemps qne l’on se base sur l’intensité de la réaction nucléale pour en déduire une plus ou moins grande concentration en ADN (SroweL en 1947 (234) a étudié des cellules de tumeurs en appréciant à l’œil l’intensité de la coloration de FeuLGen). Mais ce n’est que tout récemment que l’on a essayé d'apprécier par la photométrie la couleur développée.

L'utilisation du Feulgen pour une estimation quantitative de l’ADN pose deux sortes de problèmes ou plutôt présente deux degrés :

— Tout d’abord, l’intensité de la coloration est-elle toujours proportionnelle à la concentration de l'acide désoxyribonucléique dans le noyau considéré? En d’autres termes, l’expression numérique de l'intensité de la coloration peut-elle être considérée comme une mesure en valeur relative de la quantité d'acide désoxyribonucléique ?

— D'autre part, peut-on faire un pas de plus et calculer en valeur absolue la quantité d'ADN contenue dans un noyau donné, d’après l’intensité de la couleur déterminée photométriquement ?

Dr SrepPHANO (99) a cru pouvoir résoudre d'emblée ce deuxième problème. Il se basait sur le fait (montré par WieranD et ScneuiNG) (265) qu’une molécule de fuchsine basique, se combinerait avec deux groupes aldéhydiques libérés par l’hydrolyse (‘). Cette donnée lui permettait de calculer le nombre de molécules d'ADN intervenant dans la réaction colorée.

En réalité les calculs de Dr SrepxaNo ne sauraient être exacts. D’après les données de CasPerssoN (46), CnonG Fu-Lr et Sracey (66), OverEnD et SracEY (187), une partie seulement des molécules d'ADN entre dans la réaction.

— D'autre pait, cette réaction ne se fait pas suivant le schéma donné par WiELAND et SCHEUING.

Il semble donc bien que la détermination en valeurs absolues de quantités d'ADN, par la photométrie utilisant le Feulgen, soit impossible — tout au moins dans l’état actuel de nos connaissances —. Mais remarquons que l'obtention de valeurs absolues n’a que peu d'intérêt pour l’étude des problèmes biologiques que se propose la photométrie dans le visible. L'expression des teneurs en ADN en valeurs relatives est suffisante en soi et ouvre toutes les possibilités à cette technique. Ceci nous ramène donc au premier problème que nous avons défini : l'intensité de coloration est-elle toujours proportionnelle à la concentration de l'ADN? Sur ce point nous possédons des données théoriques qui semblent, a priori, discréditer le Feulgen du point de vue quantitatif. Mais des résultats récents ont montré sur le plan pratique

(:) La couleur serait formée par la réaction d’une molécule de réactif de Sexirr avec deux nucléotides dont les bases puriques ont été détachées.

L'ACIDE DÉSOXYRIBONUCLÉIQUE DES CELLULES ANIMALES Hi EE -

que la photométrie par le Feulgen peut être utilisée quantitativement (avec cependant certaines réserves).

Au point de vue théorique : nous avons vu que l’on connaît mal le mécanisme exact de la réaction qui aboutit à la formation du complexe coloré et que, dans cette réaction, une partie seulement des molécules d'ADN entre en jeu. D'autre part, Wipsrrôm (264) et Caspersson (46) ont établi ën vitro sur des solutions d'ADN que, si dans certaines conditions de concentration (entre 0,02 0/0 et 1,5 0/0) l'intensité de la réaction nucléale est proportionnelle à la concentration en ADN, :! n’en est plus de même lorsqu'on ne prend plus de l'ADN purifié mais de l'ADN en présence de protéines. Très récemment, SIBATANI (217) a montré qu'une addition d’histone à l’acide nucléique accroît considérablement l'intensité de la réaction colorée. Or, dans les noyaux, on n'a jamais d'ADN pur; il est toujours lié à des protéines. Il semble donc qu'a priori on ne soit pas autorisé à se servir du Feulgen pour une étude photométrique.

Malgré cela, plusieurs auteurs (99-202-235) sont allés de l'avant sur le plan pratique. Ils ont montré que, dans des conditions strictement standardisées, le Feulgen donne, sur des préparations histologiques, des résultats photométriques bien reproductibles, et Pozzisrer et Swirr (196), coupant des noyaux de foie d'Amblystoma à différentes épaisseurs, ont vu que l'extinction de la lumière, après coloration au Feulgen, est proportionnelle à l'épaisseur de la coupe, ce qui montre que, dans ce cas, l’intensité de la coloration est bien proportionnelle à la quantité d'ADN contenue dans la couche absorbante Enfin, Ris et Mirsxy (202) ont comparé les résultats d'analyses chimiques sur les noyaux aux données calculées de la photométrie : ils ont confirmé que la réaction nucléale ne donne pas des valeurs absolues pour la teneur des noyaux en ADN, car les chiffres calculés d’après la photométrie sont bien inférieurs aux chiffres donnés par la chimie. Mais, ce qui est très important du point de vue pratique, i{s ont noté une bonne proportionnalité entre la valeur trouvée par photométrie et la valeur absolue réelle déterminée chimiquement dans tous les cas qu'ils ont envisagés.

Cette constatation donne évidemment une grande valeur à la photométrie dans le visible, et permet dans une certaine mesure d’envisager son emploi comme méthode quantitative. Pour obtenir des résultats en valeur absolue, Ris (202) emploie le procédé suivant : il traite sur une même lame des noyaux à teneur en ADN connue chimiquement (Vac: valeur absolue des noyaux connus) et des noyaux inconnus et il détermine photométriquement l’absorption de ces deux types de noyaux (soient Vr c: valeur relative du noyau connu et Vri— valeur relative du noyau inconnu). Une simple règle de trois lui permet alors de calculer la teneur absolue en ADN des noyaux inconnus (Vai— valeur absolue du noyau inconnu) :

Le contrôle par l’analyse chimique des noyaux inconnus lui a montré que, dans les cas étudiés, ce procédé était légitime.

de PT

h2 COLETTE VENDRELY

D'ailleurs, répétons-le, l'obtention de résultats en valeur absolue est inutile pour tous les problèmes que l’on peut étudier. Ce qui importe c’est d’obtenir des valeurs relatives toujours proportionnelles aux valeurs absolues. Jusqu’à présent, dans tous les cas où l’on a pu effectuer un contrôle, les valeurs données par la cytochimie (FEULGEN) ont été proportionnelles aux valeurs données par la chimie. Ces importantes constatations semblent bien autoriser les auteurs à considérer la photométrie par le Feulgen comme une méthode quantitative. Mais les objections théoriques n’en demeurent pas moins et il faut souligner que, lorsqu'on ne pourra pas vérifier chimiquement les résultats cytochimiques, ceux-ci devront toujours inspirer quelques doutes. En effet, quand on passe d’un noyau à un autre noyau, et plus encore du noyau d’une espèce animale à celui d’une autre espèce animale. ou encore de noyaux au repos à des noyaux en voie de multiplication ou à des noyaux cancéreux, rien ne prouve que la quantilé et la nature de la protéine coexistant avec l'ADN soient comparables dans tous les cas, et nous avons vu que la présence de protéine modifie considérablement la coloration de Feuccen. Par conséquent, aucune conclusion définitive ne peut ètre tirée de tels résultats s'ils ne sont pas constamment contrôlés par la méthode chimique. Cette remarque nous paraît importante et nous y reviendrons, car certains auteurs utilisent exclusivement, et sans contrôle, la photométrie dans le visible. Cela nous paraît dangereux et prématuré, étant données les inconnues qui subsistent encore quant à l’utilisation quantitative du Feulgen.

d) Sources d'erreurs possibles en cytochimie photométrique. — Les autres sources d'erreurs de la méthode de Porrisrer ont été soigneusement examinées par lui-même (193) et par ses élèves (voir particulièrement Swirr (235) et par Ris et Mirsky (202) et aussi par Lesscer (140). Nous nous bornerons à rapporter les plus importantes ainsi que les procédés employés pour les réduire au minimum.

La lumière employée doit être, autant que possible, monochromatique Sinon, la relation entre l’absorption et le nombre de molécules de la couche absorbante cesse d’être linéaire.

Pour réduire la dipersion de la lumière dans le champ à mesurer, on utilise de très petites ouvertures pour le diaphragme de la lampe et celui du condensateur. L'expérience a montré qu’on réalise ainsi les conditions optima de travail. Tout récemment Naora (183) a décrit un appareil de photométrie perfectionné, dans lequel l’éclairement de la préparation est réalisé sur une surface très petite (1 à 5 u de diamètre). Les autres auteurs illuminent un champ relativement grand de la préparation et limitent la surface à mesurer photométriquement par un diaphragme placé dans le plan de l’image. Dans ce dernier cas, la valeur mesurée de la transmission pourrait être entachée d’une erreur par excès, ce quiest évité par le dispositif de NaoRa.

En outre, les noyaux fixés présentent des mottes de chromatine colorées au Feulgen entre lesquelles le noyau est incolore. Cette hétérogénéité est une grande cause d'erreur, car on a montré que l’extinction moyenne n’est proportionnelle à la transmission moyenne, que lorsque toutes les intensités dans les différents points de l’image sont les mêmes. Ces erreurs dues à l'inégalité

de distribution de la chromatine atteignent 15 o/o. On arrive à les diminuer en mesurant l'extinction d’une petite plage au centre du noyau; on peut ensuite calculer cette extinction pour tout le noyau. Cette plage ne doit pas cependant être trop petite, car elle pourrait alors ne pas représenter un échantillon typique de la distribution de la chromatine dans tout le noyau. La meilleure dimension est empiriquement celle d’une surface de 2 à 4 de diamètre.

D'autre part, le choix du fixateur est très important. Swirr a remarqué que l'emploi du formol à 5o o/o divise finement la chromatine et rend ainsi sa répartition plus homogène. Ris (202), afin d'obtenir une distribu ion plus uniforme de la chromatine dans le noyau, préconise leur isolement dans du sucrose à 30 0/0 avant de les fixer par du formol à 20 o/o. Cette manière d'opérer a été critiquée par Pasreezs et Lison.

La forme du noyau : quand les noyaux sont parfaitement sphériques ou ovoïdes, il est possible de rapporter l'extinction mesurée à leur volume entier, connaissant les dimensions de leur diamètre ; mais quand la forme en est nettement irrégulière, l'évaluation du volume ne peut être que grossière ou impossible. Ceci limite l’utilisation de cette technique à un certain nombre de types de noyaux à l’exclusion des autres. D'autre part, les noyaux très petits à chromatine très dense ne peuvent être mesurés, la lumière transmise à travers eux étant pratiquement nulle.

IL est évident d’autre part que l’épaisseur de la section des coupes doit être envisagée : Si l’on prend des coupes trop fines, on risque de sectionner les noyaux et de n’en mesurer ainsi qu'une tranche. Avec des coupes trop épaisses, on risque d’avoir plusieurs épaisseurs de noyaux. L’épaisseur des coupes (6 à 12 y et davantage) doit être choisie en fonction de la grosseur des noyaux contenus dans le tissu. Notons ici que certains noyaux (noyaux polyploïdes du foie de Rat par exemple) peuvent avoir couramment des diamètres de l'ordre de 15 y. Cette considération paraît bien simpliste; en réalité elle a son importance : il est parfois très difficile de juger si un noyau est entier ou partiellement sectionné. Nous avons pu voir, — en comparant les résultats donnés par des mesures sur coupes de tissus et sur noyaux isolés en frottis, — que la marge d'erreur est bien moins élevée dans le deuxième cas que dans le premier.

Enfin, dans certaines cellules, des substances de réserve peuvent gêner considérablement la coloration de FEuLGEN qui est alors très faible : citons notamment le cas de certaines cellules adipeuses, celui des œufs riches en vitellus. Une mesure photométrique ne saurait donc être envisagée qu'avec une extrême prudence sur un tel matériel.

Nous pouvons donc conclure en disant que cette technique photométrique doit être utilisée avec prudence et clairvoyance dans les limites de ses possibilités. Le contrôle constant fourni par des dosages chimiques dans tous les cas où cela est possible, donnera de la solidité aux résultats. Nous avons vu d’ailleurs que jusqu’à présent les données de la cytochimie photométrique concordent pratiquement assez bien avec celles de la chimie, ce qui nous permet d'espérer beaucoup de cette technique cytochimique malgré les importantes objections théoriques que l’on peut lui faire.

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e) La technique de Lason.

L'appareil de photométrie construit par Lison (148) est basé sur le même principe que celui des auteurs américains. Il en diffère cependant par certains détails. L'image du noyau, au lieu d’être limitée par un diaphragme et d’être reçue sur la cellule photoélectrique. est projetée agrandie sur un écran percé d’un trou derrière lequel est placée la cellule photosensible. Cette cellule est en rapport avec un multiplicateur d'électrons qui amplifie la réponse et un micro ampéremètre qui permet la lecture de la mesure. On peut ainsi mesurer l'intensité de la coloration en différents points du noyau et rapporter ensuite ces mesures à tout le noyau dont la surface est déterminée planimétriquement.

Nous n'avons pas utilisé personnellement cet appareil. Son auteur pense qu’il est plus maniable que celui de Pozzisrer et permet de travailler beaucoup plus rapidement, et d'obtenir un plus grand nombre de résultats.

3) ÉTUDE DE LA TENEUR EN ACIDE DÉSOXYRIBONUCLÉIQUE DE NOYAUX DE BŒUF ET DE RAT PAR LA TECHNIQUE DE POLLISTER

Nous avons vu, dans notre premier chapitre, au cours de la discussion que, si de nombreuxauteurs ont confirmé nos résultats sur la constance de la teneur en ADN des noyaux, Mirsxy et Ris (174) d’une part, PasrgeLs et Lison (188) d’autre part, ont apporté des résultats en net désaccord avec les nôtres.

Rappelons que Mirsxy et Ris ont trouvé (par des dosages chimiques sur noyaux isolés dans le thymus et le ganglion lymphatique du Veau, le rein et le foie du Bœuf) un montant d'ADN par noyau qui était de 2,5 et 3 fois plus élevé que celui du spermatozoïde de la même espèce, alors que nous avions trouvé pour les noyaux de ces organes une teneur exactement double de celle du sperme.

D'autre part, Pasrezzs et Lison, par leur technique photométrique, trouvaient dans le noyau de pancréas et de foie de Rat une teneur qui était seulement de 1,3 à 1,5 fois celle du spermatozoïde.

Ainsi Mirsxy et Ris trouvaient des valeurs beaucoup plus élevées et PAsTEELS et Lison des valeurs beaucoup plus basses que les valeurs théoriques. Il est évident que de telles variations, si elles étaient confirmées, représentaient une grave objection à la théorie que nous avions établie. Nous avons donc voulu reprendre le même matériel que ces auteurs et l’étudier à nouveau, à la fois par la technique chimique et par la technique photométrique avec l'appareil de Pozzisrer. Un séjour à la Western Reserve University de Cleveland, au Laboratoire dn Professeur C. LEUGHTENBERGER, avec qui nous avons fait ce travail (142-245), nous a permis d'effectuer cette étude comparée (1).

a) Matériel. — Nous avons utilisé du foie, du rein, de la rate et du sperme de Bœuf, de Taureau et de Rat. Les noyaux furent isolés et le dosage chimique de l’ADN effectué comme nous l’avons exposé ci-dessus (chapitre I). Pour le travail cytochimique, la même suspension de noyaux fut utilisée en frottis

He Nous désirons remercier vivement le Docteur Allan Mornis, Directeur du département de Pathologie de la Western Reserve University qui nous a donné de très larges facilités pour effectuer ce travail.

fixés au Carnoy (!) et en frottis fixés au formol à 5o o/o (formol du commerce dilué deux fois), puis traités suivant la technique de FeuL&ex. L'étude photométrique fut faite parallèlement sur ces frottis et sur des coupes des mêmes organes fixés au Carnoy et au formol à 50 0/0.

b) Résultats cytochimiques et résultats chimiques. — Le tableau ci-joint groupe les résultats obtenus chez le Bœuf et le Rat par la méthode chimique et par la méthode cytochimique.

La teneur de chaque noyau en ADN, évaluée par la cytochimie, estexprimée en umités arbitraires; on ne doit donc considérer que les rapports entre eux des différents résultats dans chacune des deux méthodes.

Si nous considérons tout d’abord les résultats cytochimiques pour le Bœuf et le Taureau, il apparaît nettement que les différents tissus étudiés ont approximativement la même teneur en ADN par noyau et que cette teneur est le double de celle du sperme. !

Les résultats en valeur absolue (10-$ ;) donnés par l’analyse chimique des mêmes noyaux montrent le même rapport.

En ce qui concerne le Rat, l'analyse cytochimique montre l'existence dans le foie de trois classes de noyaux dont les teneurs en ADN, par noyau, sont respectivement (en unités arbitraires) de 3,3, 6,6 et 12,1. ces trois valeurs sont presque exactement des multiples les unes des autres. Dans le rein au contraire, il n'existe qu’une seule classe de noyaux dont la teneur en ADN est la même que celle de la classe inférieure des noyaux du foie.

TaBreau I

Teneur en acide désoxyribonucléique (ADN) de noyaux isolés de différents tissus de Bœuf et de Rat, déterminée par analyse chimique et cytochimique.

Analyse cytochimique Analyse chimique us MERE Nombre Teneur moyenne | Teneur en ADN de noyaux en ADN par noyau par noyau étudiés (unités arbitraires) (10—$ y)

Bœuf Foie 30 SRE O NU 6,8

Bœut Rate 23 3,0 + 0,08 7,0

Bœuf Rein 26 3,3 + 0,10 6,4 Taureau Spermatozoïide 25 1,6 + 0,08 3,3

Rat Foie | 15 3, 91=510,08

Rat Foie 21 6,6 + 0,24 8,2

Rat Foie 7 12,12 0,90

Rat Rein 38 3,3 + 0,06 5,5

(:) Le Carnoy utilisé diffère de la formule habituelle en ce qu’il ne contient pas de chloroforme.

Voici sa formule :

Alcool absolu,

Acide acétique.

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L'analyse chimique ne permet évidemment pas de discerner les trois classes de noyaux dans le foie puisqu'elle porte sur une masse de noyaux qui est un mélange de ces trois types. Le résultat (8,2) est doncune valeur moyenne, qui est nettement plus élevée que la teneur par noyau trouvée dans le rein (5,5).

c) Discussion. — Il apparaît donc qu'en ce qui concerne le Bœuf, nos résultats, tant chimiques que cytochimiques, sont en parfait accord et nos premières constatations se trouvent vérifiées. Nous pouvons donc affirmer la constance de l'ADN dans les différents noyaux somatiques étudiés et sa teneur moitié moindre dans le spermatozoïde. Signalons d’ailleurs, que dans ces organes de Bœuf et de Veau, la polyploïdie est exceptionnelle. Nous n'avons trouvé par photométrie, au cours de toutes nos investigations, que deux noyaux contenant 4 fois la teneur en ADN du spermatozoïde. Nous avons rencontré également un très petit nombre de noyaux contenant une quantité d'ADN inférieure à celle des autres noyaux. Il s’agit là très vraisemblablement de noyaux en voie de dégénérescence, provenant probablement de cellulesen train de mourir, et dont la présence est logique dans tous les tissus vivants. On peut aussi expliquer quelques-uns de ces résultats divergents par une erreur — toujours possible — dans les mesures photométriques. Quoi qu'il en soit, ces écarts (noyaux polyploïdes ou noyaux inférieurs à la normale) sont proportionnellement insignifiants par leur nombre. L'ensemble des résultats cytochimiques est remarquablement homogène et confirme absolument nos résultats chimiques. Mirsky, nous l’avons vu, a d’ailleurs publié tout récemment (176) une mise au point sur ce sujet et a reconnu que ses premiers résultats sur le Bœuf étaient entachés d’erreurs.

Si nous considérons maintenant les résultats obtenus chez le Rat, la présence dans le foie de trois classes de noyaux contenant respectivement des teneurs en ADN multiples les unes des autres, est tout à fait en accord avec les trois classes de noyaux signalées par Mirsky et Ris (202). Nous avons également trouvé un excellent accord entre les mesures faites sur noyaux isolés et les mesures faites sur des coupes de tissus.

Cependant, nous l'avons vu, Pasreezs et Lison trouvent bien ces trois classes de noyaux, mais les teneurs en ADN de leurs noyaux sont beaucoup plus faibles par rapport à celles des noyaux d’autres organes contenant uniquement des noyaux diploïdes à teneur en ADN double de celle des spermatozoïdes. Ainsi, tandis qu'ils trouvent pour les noyaux du rein la valeur arbitraire 227, les trois classes de noyaux du foie ont respectivement 156, 347 et 772. La valeur minimum pour le foie est donc de 30 0/0 inférieure à celle du rein.

Or, nous n'avons pas retrouvé ce phénomène chez aucun des six rats que nous avons étudiés : les noyaux de la classe inférieure du foie ont exactement la même valeur en ADN que les noyaux de la classe unique du rein. D’autres auteurs (Ris et Mirsky (202), Swirr (235)) étudiant photométriquement les noyaux du Rat, sont également en désaccord avec Pasreezs et Lison. Les auteurs belges n’ont donc actuellement — et ils attirent eux-mêmes l'attention sur cette constatation — été confirmés sur ce point par aucun auteur.

Rappelons que la technique chimique ne peut donner pour le noyau de foie du Rat qu’une valeur moyenne, cette moyenne, nettement plus élevée que la