LES POSSIBILITÉS DE LA CYTOCHIMIE PHOTOMÉTRIQUE DANS LE VISIBLE

a) Travail sur de petites quantités de matière. — Tout d’abord, le cytochimiste travaillant sur coupes de tissus ou sur frottis n’a besoin que d’une très petite quantité de matière pour effectuer ses mesures, alors que le chimiste ne peut travailler avec précision que sur des masses importantes de noyaux. Ainsi SwirT (235) a pu, grâce à la technique de cytochimie photométrique, effectuer uve étude très poussée de l'ADN des noyaux de nombreux tissus de la Souris blanche : foie, pancréas, thymus, lymphocytes, cellules de Serroz1, tubes urinifères du rein, épithélium de l’instestin grêle, rate, neurones (moelle épinière), cellules interstitielles du testicule, soit ro types de noyaux différents dans un même animal. Ces noyaux ont une teneur en ADN double de celle de la spermatide, et dans plusieurs organes (foie, pancréas, etc...) se retrouvent deux ou trois classes de noyaux ayant le double ou le quadruple de la teneur normale en ADN.

Swirr a étudié aussi avec des résultats comparables divers tissus de la Grenouille (Rana pipiens).

Il a pu également étudier les noyaux au cours de la spermatogénèse chez la Souris. Les noyaux préméiotiques sont de deux sortes : les uns ont pour teneur en ADN, en unités arbitraires, 3,28, et les autres 5,96. Les spermatocytes de premier ordre, 6,28, les spermatocytes de second ordre, 3,35 et les spermatides, 1,68. Comme on le voit, la teneur en ADN est le quadruple de celle des spermatides dans les noyaux préméiotiques les plus évolués et dans les spermatocytes de premier ordre, qui contiennent ainsi respectivement tout l'ADN nécessaire aux 4 spermatides qui dériveront d’eux par deux divisions successives.

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b) Le problème de la polyploïdie intra<issulaire. — La prèsence dans certains organes des Rongeurs d’une proportion importante de noyaux polyploïdes a été signalée depuis longtemps, nous l'avons vu, et là constatation de la présence de classes de noyaux contenant des valeurs double et quadruple des valeurs normales en ADN est venu placer sur le plan eytochimique le problème de cette polyploïdie intratissulaire, qui est certainement d'un grand intérêt du point de vue physiologique.

On savait que cette polyploïdie, rare chez les jeunes, est très marquée chez les animaux d'un certain âge.

Swier à montré que chez la souris de 10 jours, la majorité des noyaux étaient de la elasse L (diploïdes) et que la elasse III (ortoploïdes) n'était pas représentée du tout. Chez l'adulte, les noyaux de la classe Il (tétraploïdes) sont aussi fréquents que ceux de la classe I. Chez l'adulte on ne trouve pas de valeurs intermédiaires entre les classes. Mais chez la souris de 1e jours quelques mesures étaient intermédiaires entre la elasse 1 et la classe IL. Il s'agit probablement de formes de transition. Le rapport entre la fréquence de cette polyploïdie et l'âge des animaux est certainement un fait à retenir (4e) et son interprétation serait du plus haut intérêt. D'autres facteurs influent également sur là polyploïtie : régénération (6), substances chimiques, cancer (73), ete. I y à Là un problème intéressant qui s'ouvre aux histophrsielogistes.

ce) Le problème des ovocytes. — Nous avons vu, dans le chapitre préeédent, que l'on ne peut pas, à l'heure actuelle, effectuer, par la méthode chimique, le dosage de l'ADN dans les œufs d'oursins ni dans les œufs en général. C'est évidemment là un cas où la technique microphotométrique doit montrer ses possibilités. Pour le problème particulier des œufs d'oursins, Mask et Ris (175) ont pu montrer tout récemment qu'après fécondation, les deux pronuclei mâle et femelle ont exactement la même teneur en ADN et sont ‘ haploïdes. Antérieurement à ces auteurs, ALrert ($) avait consacré une étude complète au problème de l'ADN des noyaux au cours de l'evogénèse et de la segmentation de l'œuf chez la Souris. Il à pu montrer que parallèlement à ce qui se produit dans le testicule, les ovoertes primaires de la Souris présentent une teneur en ADN égale à 2 fois la valeur trouvée dans un norau diploïde de la couche épitheliale de la trompe de Fallope (ou moitié de ce qui est trouvé dans un noyau octoploïde du foie). Cette mème proportion d'ADN existe déjù dans les avocytes tout petits, À peine reconnaissables, Au cours de le eris: sance de l'ovocyte, l'accruissement du volume nueléaire entraine une dilution progressive du contenu nucléaire et produit une réduction apparente de ta colorabilité au Feulgen. Bien que les stages intermédiaires de là méiese n'aient pas pu être suivis, du Fait que les chromasomes ne reforment pas un noyau au repos (ce qui est essentiel pour de bonnes mesures photométriques (Hiuss) (119)), les pronuelért femelles qui finalement apparaissent ent ex quart de la teneur en ADN des evocytes primaires.

Axrerr rapporte enfin les résultats d’une série de mesures faites sur les noyaux résultant des premières divisions de segmentation : ees noyaux contiennent le double de la teneur en ADN des pronueléi. Ils sont diplekles et cette teneur est elle-mème très vite doublée dans ces noyaux se divisent rapidement pour préparer la division suivante.

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Toutes ces constatations sont parfaitement en accord avec la théorie qui fait de l'ADN un matériel essentiel dans l’hérédité puisque sa teneur par noyau se montre aussi constante que leur équipement chromosomique et se comporte de la même façon. Elles sont en désaccord avec un certain nombre de travaux antérieurs, qui tendait à montrer l'ADN des noyaux en maturation et segmentation comme une substance éminemment transitoire et fluctuante. De très nombreux auteurs n’ont pu obtenir de réaction de Feulgen positive dans des ovocytes de différentes espèces, en développement (Kocn (129), Higsarp (117), Korrzorr (130), Gormié et Tsarsaris (111), SERRA (215), MoricarD (168)). Bracuer (32-37) a exprimé l’idée que, tandis que le contenu en ADN des œufs vierges et des cellules résultant des premières divisions de segmentation est très faible, il s'accroît graduellement pendant le développement aux dépens de l’acide ribonucléique cytoplasmique. Dans le cas particulier des œufs de Souris, Goruté et Tsarsaris (111) ont pensé qu'ils étaientabsolument dépourvus d'ADN à certains stades. Ces travaux ont été effectués uniquement par des méthodes cytologiques, l'intensité de coloration du Feulgen étant appréciée à l'œil. L'emploi de la cytochimie photométrique a donc permis de reprendre ce problème avec une plus grande précision et les résultats d’ALrerr sur les ovocytes de Souris apportent une lumière nouvelle sur une question qui demeurait assez confuse.

d) Ætude de la multiplication cellulaire : milose et méiose, embryologie, hématopotèse. — Enfin la cytochimie photométrique peut permettre d'aborder directement le problème de la division cellulaire et de suivre l'ADN d’un noyau en plein cycle mitotique. Il est évident qu'ici, plus qu'ailleurs, une grande prudence doit être de mise. On sait, en effet, d’après les travaux de CaspErsson, que la coloration de FEuLGEN peut être influencée par la présence des protéines coexistant avec l'ADN. Or, durant la mitose, on admet que les histones sont modifiées, au moins quantitativement. Aussi, les résultats, de la technique de cytochimie photométrique ne doivent-ils être envisagés qu'avec beaucoup de réserve chaque fois qu’il s’agit de cellules en voie de multiplicalion.

Déjà, en 1947, Ris (201) avait étudié par la technique photométrique dans le visible les mitoses de méristème de racine d’oignon et des méioses de la spermatogénèse de Chorthophaga. Cet auteur montrait que la richesse en ADN du noyau augmente au cours de la prophase pour atteindre son maximum à la métaphase, la valeur étant alors deux fois supérieure à celle d’un noyau normal. Les valeurs de chaque anaphase sont les mêmes que dans le noyau normal. Ces données étaient en accord dans leurs lignes générales avec le travail classique de Caspersson (1939-1941) (48-51) qui avait étudié le problème de la mitose et de la méiose par la photométrie en ultra-violet. La synthèse de l'ADN débuterait donc avec le processus mitotique et ne se terminerait qu'au moment de la séparation des chromosomes fils.

Cependant, des travaux récents (Swirr (235), Azrenr (3)) tendent à montrer que, à la prophase de la mitose, la synthèse de l'ADN serait terminée et que le noyau contiendrait déjà le double de la teneur en ADN du noyau normal. Dans la méiose (Lison et Pasrsezs (149), Swirr (235), SCHRADER et LEUCHTENBERGER (212)) les spermatocytes de premier ordre contiennent deux

BULL, BIOL,, fasC. 1, 1952. n

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fois la teneur du noyau normal, c’est-à-dire la valeur des quatre spermatides qui vont en dériver par deux divisions successives.

Nous avons nous-même tenté d'aborder le problème de la synthèse de l'ADN dans la division cellulaire en essayant d'isoler à partir de testicules de Taureau des noyaux de spermatocytes en prophase. Ces noyaux, très reconnaissables par leur grosse taille et leur filament de chromatine fortement contourné, sont en assez grand nombre dans les tubes séminifères pour qu’on puisse espérer en obtenir des quantités suffisantes pour un dosage chimique. Nous avons pu en obtenir des suspensions très riches (60 0/0), mais nous n’avons malheureusement pas pu nous débarrasser complètement des autres noyaux, en particulier des spermatozoïdes haploïdes, malgré des centrifugations différentielles répétées. Cependant, la comparaison des dosages effectués sur une suspension de noyaux isolés du testicule (et contenant normalement une proportion assez faible de noyaux en prophase) et des suspensions progressivement enrichies en prophases, nous a montré que dans le premier cas le chiffre moyen obtenu en divisant le résultat du dosage total par le nombre de noyaux se situait entre la valeur haploïde des spermatozoïdes et la valeur diploïde. À mesure que le nombre des prophases augmentait dans le mélange, ce chiffre moyen s’élevait pour atteindre finalement une teneur supérieure à la valeur diploïde — ce qui tendrait à prouver qu’effectivement les noyaux en prophase sont déjà considérablement enrichis en ADN et contiennent vraisemblablement l'ADN nécessaire pour les deux noyaux fils.

Tout récemment, Pasreezs et Lison (189), étudiant des mitoses d’érythrocytes d’embryon de Rat, des glandes de Lieserküan de Rat adulte et de cultures de fibroblastes de cœur de Rat, auraient trouvé que, dans ces cas, la synthèse de l'ADN s’effectuerait immédiatement après la télophase au cours de la reconstitution du noyau. Les noyaux fils à peine reformés contiendraient donc déjà le matériel nécessaire à leur future mitose.

Aux mêmes conclusions aboutissent SESHAGHAR (216) en ce qui concerne le micronucléus d’un Infusoire (Chilodonella) et BuzrouGn et Pasrezs (41) étudiant la division cellulaire dans l’épiderme de la Souris.

Cette conception s’accorderait assez bien avec les théories des cytologistes . (DEHoRNE, DARLINGTON) qui ont montré que la fissuration des chromosomes s'effectue dès la fin de la télophase, préparant déjà la mitose suivante.

ILest évident que ces recherches toutes récentes demandent de nouvelles vérifications, car elles s'adressent à un matériel, qui, de l'avis des auteurs eux-mêmes, est très difficilement abordable par la photométrie. Elles n’en présentent pas moins un grand intérêt et mériteraient certainement d’être reprises. Remarquons que les différents auteurs que nous avons cités, travaillent sur des matériels différents (méristèmes végétaux, embryons animaux, tissus en culture, érythrocytes, testicules) et l’on ne saurait encore, dans l’état actuel de la question, se baser sur des résultats en apparence divergents ; il est possible que les processus diffèrent suivant les conditions de la division cellulaire.

e) Embryologie. — Pasrees et Lison (150) ont étudié l’ADN des noyaux de l'embryon d’Oursin au cours de son développement. Iis ont trouvé que la

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teneur en ADN des noyaux est d'autant plus élevée que la fréquence mitotique est plus grande (elle atteint jusqu'à 8 fois la teneur du spermatozoïde : 8 S dans l’œsophage). Quand survient un ralentissement de la multiplication (par exemple au stade blastula) cette teneur fléchit partout où elle était élevée. Ceci ne doit pas nous surprendre : On imagine aisément, en effet, que les noyaux se préparant à une série de divisions successives (trop rapides pour que des synthèses puissent s’y faire) fassent en quelque sorte provision d'ADN pour plusieurs mitoses. Enfin, disent ces auteurs : « Lorsqu'on étudie l'allure des courbes représentant l'évolution quantitative des diverses lignées cellulaires, on ne peut manquer d'être frappé par le fait qu’elles convergent à certains moments vers des valeurs qui sont les valeurs 4 S et 2 S » (4S au stade blastula avancé, 2 S au stade pluteus). Au stade pluteus pratiquement toutes les cellules de l’embryon ont la valeur 2 S, sauf celles qui sont impliquées dans la formation des bras qui continuent à se développer activement. L'état d'équilibre à la valeur 2 $S estatteint lorsque les organes primordiaux de l’embryon sont en place et que la multiplication cellulaire a ‘ cessé d’être particulièrement active. Ceci nous paraît confirmer une fois de plus le rôle important que doit jouer l'ADN dans la biologie du noyau cellulaire en général et dans sa division en particulier.

Citons, pour terminer, un travail tout récent d’un élève de PAsTEELs et Lison, MaRINONE (159), qui a abordé par la même technique que celle de ces auteurs, le problème de l'ADN des noyaux dans la maturation des cellules sanguines des diverses lignées dans la moelle osseuse.

Conclusion. — Nous avons pu constater au cours de ce chapitre que la cytochimie photométrique dans le visible, malgré les critiques et les restrictions qu’elle mérite du point de vue théorique et quant à l'interprétation de ses résultats, a démontré ses possibilités dans le domaine pratique : son accord complet avec les résultats de la chimie dans les nombreux cas déjà étudiés, les nombreux problèmes qu'elle a permis d'aborder () (dans le domaine de la division cellulaire, de la polyploïdie intratissulaire, de l’'éèmbryologie, etc.), confèrent à celte jeune science un acquit suffisant pour qu’on puisse espérer la voir devenir un jour un instrument précieux entre les mains de très nombreux biologistes. Cependant, il ne faut pas oublier que la technique photométrique dans le visible ne saurait donner une certitude absolue. Elle n’a pas l’élégante spécificité de la photométrie en ultra-violet, et l'emploi simultané de la photométrie dans le visible et dans l’ultra-violet donnerait, si les résultats concordaient, une plus grande confiance dans la cytochimie au Feulgen, dans tous les cas surtout où la vérification chimique est impossible.

(:) Très récemment ALrert et BERN (4) ont publié un travail de cytochimie photométrique portant sur les noyaux des cellules des glandes de l'utérus de Rat ovariectomisé. L’injection d'æstrone détermine un accroissement très notable du volume de ces noyaux. Les auteurs ont vérifié que le contenu en protéines augmente parallèlement à l'accroissement du volume nucléaire, alors que la teneur en ADN demeure inchangée.

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LU. — Cytochimie photométrique en ultra-violet.

La technique décrite en 1936 par Caspersson (47-30) utilise, nous l'avons dit, la propriété des acides nueléiques d'absorber les radiations ulira-violettes dans la longueur d'onde de 2.600 À. Casprrssox l'a utilisée prineipalement pour étudier l'acide nueléique du eytoplasme (l'acide ribonueléique) et ses variations au cours de différents états physiologiques de la cellule (4a-31-34- 55-56-58-39). Quant à l'acide désoxyrihonueléique, Casperssox l'a peu étudié, A l'exception de ses travaux sur la localisation de cet acide dans les handes des chromosomes géants et sur ses variations dans les chromosomes au cours de la mitose (47-48-57) on ne relève dans son œuvre aucun travail système tique se rapportant à l'ADN du noyau.

Comme nous l'avons montré dans ce qui précède, la constance de l'ADN dans tous les noyaux d'un même organisme et sa réduction de moitié dans les gamètes, à êté d'abord établie chimiquement, puis confirmée par le eytochimie au Feulgen, et il nous à paru que l’utilisation d'une troisième technique de la valeur de celle de Caspersson n était pas superflue pour asseoir encore plus solidement un fait biologique de cette importance,

C'est à l'instigation des Docteurs G. et R. Lrucurexssresr de Cleveland (U. S. A.) et avec le plein accord du Professeur Caspersson (') que nous avons entrepris au Karoliaska Intitutelà Stockholm un travail en équipe (143), travail de chimie et de photométrie comparée sur l'ADN de noyaux sometiques et de spermatozoïdes. Nous nous sommes chargés plus partieulièrement de la partie chimique du travail (préparation et mise au paint du matériel), les Docteurs LEUCRTENSERGER se sont occupés des mesures d'absorption.

1) Description de la technique.

La technique photomètrique de Casekrsson est désormais elassique et bien connue de tous les biologistes Nous nous bornerons done à décrire dans ses grandes lignes la photométrie sur plaques photographiques que nous avons utilisée pour le travail courant (L'utilisation de l'appareil &e photemétrie directe n'ayant pas êté nécessaire pour ce problème).

Cette technique comprend quatre temps :

1) La microphotographie en ultre-violet du matériel à étudier dans des conditions strictement standardisées et sur des plaques rigoureusement homogènes et identiques.

2) La mèsure de la transmission de la lumière à travers la plaque photagrephique au niveau de l'image et au niveau du fond de la plaque. L'iaseription graphique de cette mesure est faite grâce au densitomètre À SISRARN.

3) La conversion des résultats dounès par le densitomètre en mesure d'extinetion correspondant aux noyaux. Cette conversion se fait grâce à une courbe de rétérence établie en mesurant au Sigbahn la densité en différentes zones d'une

(1) Nous sommes heureux d'exprimer ici toute notre reconnaissance au Pro-

Fesseur Gaspsrssox pour l'hospitalité qu'il nous a accordée dans son bel Institut et pour les facilités de travail qu'il nous à prodiguées.

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même plaque impressionnée par des intensités lumineuses progressivement croissantes. (La plaque est placée sur le microscope à ultra-violet comme pour une micro-photographie, mais la lumière ne traverse qu’une préparation témoin, c'est-à-dire une lame vide montée avec sa lamelle).

4) Calcul des résultats en valeur absolue. Le calcul des teneurs Q en ADN des noyaux étudiés se fait par la formule suivante :

AXE Q—=<" mg

dans laquelle À est la surface du noyau en millimètres carrés déterminée sur plaque par planimétrie et calculée en tenant compte du grossissement du microscope, E l’extinction dans le noyau et : l'extinction d’une solution étalon d’acide ds de de : mg. par centimètre cube sur une épaisseur de 1 cm. £ — 20).

2) Adaptation de la technique au matériel à étudier : les noyaux cellulaires.

L'application de la technique aux noyaux d’une coupe histologique était pratiquement impossible. En effet, l’ultra-violet est absorbé également par les deux acides nucléiques : acide ribonucléique et acide désoxyribonucléique. Or quand la coupe est assez épaisse pour contenir le noyau entier, il y toujours au-dessus et au-dessous de ce dernier une couche de cytoplasme absorbant qui fausse toutes les mesures. En outre, dans les tissus fixés, le matériel absorbant du noyau (chromatine) est réparti de façon très peu homogène, ce qui est une cause d'erreur considérable. L'utilisation de matériel traité par la méthode d’Azrmanx Gers (congélation dans le vide) ne présente pas d’avantage suffisant pour parer à cet inconvénient. Enfin le noyau contient une petite quantité d'acide ribonucléique dans le nucléole, ce qui doit forcément fausser par excès les déterminations d'ADN.

Nous avons évité tous ces obstacles en utilisant des noyaux isolés par l’acide citrique puis mis en suspension dans de la glycérine (qui est le milieu de montage utilisé pour la photographie en ultra-violet). On place une goutte de cette suspension entre une lame et une lamelle de quartz. Après traitement par l’acide citrique, il n’y a évidemment plus de cytoplasme. L’acide ribonucléique du nucléole est probablement éliminé en partie et la chromatine reste d’une homogénéité très satisfaisante, du fait d’une fixation très douce et progressive sous la seule action de l'acide citrique, surtout si l’on fait les photographies dès que la préparation du matériel est achevée. (Les résultats sont moins bons si l’on attend plusieurs jours). Rappelons — nous l'avons montré précédemment (cf. p. 18) — que les noyaux isolés par la technique que nous utilisons ont exactement la même teneur en ADN que les noyaux des tissus vivants. On est donc en présence d’un matériel très favorable pour la photométrie en ultra-violet, et c'est grâce à cette préparation de noyaux isolés que nous avons pu mener à bonne fin un problème qui paraissait dès l’abord hérissé de difficultés.

Nous avons étudié des noyaux de foie et de thymus de Bœuf et de Veau, des spermatozoïdes de Taureau et des noyaux de foie de Rat.

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3) Résultats.

Nous rapportons dans le tableau suivant (Tableau 1) les résultats pour l'ADN de l'analyse spectro-photométrique en ultra-violet de ces noyaux, ainsi que les résultats de l'analyse chimique de l'ADN et des protéines sur le même matériel.

TABLEAU I Teneur Teneur Teneur Teneur Nombre moyenne moyenne moyenne moyenne Animal Tissus |de noyaux ne eu ee ue x ne APE mesurés Y J ; T par noyau par noyau par noyau | par noyau (par U. V.) |(parla chimie)| (chimie) (chimie) Bœuf Foie k2 De 9=E "0 T1 6,4 0,3 20,8 Veau Thymus 16 57-2022 6,4 0,5 14,3 Taureau | Sperme 56 200 03 373 0,1 14 ‘ 6,0 + 0,40 Rat Foie 47 10/0 o.20| 8,6 — — Æ

L'aspect des noyaux photographiés en lumière ultra-violette (photo 1) rappelle l’image des noyaux observés dans des cellules vivantes au micro-

Photo 1. — Noyaux de cellules hépatiques de Bœut (Photographie en lumière ultra-violette, À = 2.570À).

Eh

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scope à contraste de phase : l’homogénéisation de la chromatine est satisfaisante ; les courbes obtenues au densitomètre ne présentent que de petites irrégularités et permettent une mesure suffisamment. précise (fig. 1). En ce

Fa. 1.

. Courbes oblenues grâce à un densilomètre enregistreur sur des photographies de noyaux defoie de Rat, foie de Bœuf, thymus de Veau et spermatozoïde de Taureau à 25% À