V. — ENSEMENCEMENT ET ISOLEMENT DES GERMES

Les produits prélevés sont ensemencés en conditions aérobies et anaérobies.

A. — Séparation i>fs aérobies

La séparation des aérobies est faite sur gélose inclinée. On ensemence par stries plusieurs tubes de gélose. Il y a lieu d'ensemencer très pauvrement ou assez richement, suivant <pie l'examen microscopique fera présumer l'abondance ou la rareté des germes aérobies. Nous ensemençons toujours la gélose inclinée dans le fond du tube pour l'isolement du B. profeus (Technique de Choukewitch .

H. — Séparation dfs anaérobies

i" Milieux utilisés. - Nous n'utilisons pour les séparations que les trois milieux suivants :

Gélose de Veillon : gélose profonde glucosée à a p. roooj nitratée à ■> p. 1000 ;

LES MU ROBES DES I.NFEC1 IONS G Wi i SI S •).)

Bouillon Martin glucose à a />. 1000 ;

Bottillon Martin non glucose, additionné d'un cube de blanc d'ivnf.

>° Ensemencement des sérosités. — Nous employons les trois procédés suivants :

a) Technique de Veillon. — Cette technique rend de grands services à la condition que 1rs séparations soient bien réussies.

<>n ne peul espérer isoler «les germes en cultures pures, en partant de colonies obtenues en gélose profonde, qu'autanl que l'un ne repiquera que celles qui sont parfaitement Lien séparées. Nous ne sommes satisfaits d'une séparation que si nous avons réussi à obtenir quelques colonies au plus par tube de gélose, e1 de préférence une seule. Dans ces conditions, le repiquage de la colonie unique donne, le plus souvent, une culture pure.

L'ensemencement des tubes de gélose profonde doit être réglé d'après l'abondance des germes dans les prélèvements. Si l'examen microscopique révèle un grand nombre fie microbes, il est indiqué de procéder à des dilutions avant d'ensemencer. Si les bacilles son) très rares, il y a lieu d'ensemencer directement la sérosité et, parfois même, assez, richement. < let te indication de bon sens prend une grande valeur lorsqu'on cherche à isoler le H. œdematiens qui pousse beaucoup moins facilement dans la gélose que d'autres anaérobies, comme le />. perfringens ou le li. spordgenes.

b) Chauffage du bouillon préalablement cnscmcm-c. — Cette technique est des plus utiles pour faciliter la séparation des germes sporulés. Nous ensemençons ricliement une série de tubes de bouillon .Martin glucose à 2 pour 1.000 et de bouillon additionné d'un cube de blanc d'oeuf. Les tubes onl été préalablement régénérés par 3o minutes d'ébullition et refroidis à 4o°.

Après l'ensemencement, on les soumet à l'ébnllition pendant .'>. .">. m, 20, 3o minutes el on fait le vide.

Il arrive parfois que les cultures obtenues par chauffage sont pures d'emblée. Le plus souvent, ou bien elles renferment manifestement plusieurs germes, OU bien elles paraissent pures mais des ensemencements successifs montrent qu'elles renfermaient plusieurs espèces. C'est ainsi que telle culture pourra donner clie/ le cobave les lésions caractéristiques i\\\ B. œdematiens, être neu-

tralisée par le sérum spécifique, et montrer néanmoins, après plusieurs repiquages, du B.sporoffenes,âù B. tetani, etc..

Les cultures obtenues en bouillon par chauffage sont repiquées en gélose profonde pour la séparation des germes.

c Procédé de Choukévitch. — Lorsqu'on a à faire à une sérosité riche en microbes variés où dominent les aérobies ou les anaérobies facultatifs, l'isolement des anaérobies est extrêmement difficile. C'est le cas habituel pour la sérosité des plaies. Il est alors indiqué d'ensemencer la gélose au sortir du bain-marie à l'ébullition (entre 90 et 95°). On arrive ainsi, habituellement, à conserver toutes les espèces spondées.

Repiquage des cultures. — Quand on veut repiquer une culture de bouillon en bouillon, il est toujours nécessaire de régénérer le bouillon à ensemencer par une ébullition prolongée.

Lorsqu'on repique les colonies de gélose en bouillon, il est presque obligatoire, au moins pour certains germes comme le B. œdernatiens, le B. tetani. etc., d'utiliser un bouillon absolument frais, préparé le jour même et ensemencé tiède (bouillon Mai tin glucose à :> p. 1000). Malgré cette précaution, on a fréquemment des insuccès. C'est ainsi que pour 33 cas où nous avons eu le H. œdematiens en culture impure, nous n'avons pu isoler ce germe que i.~> fois, par repiquage de gélose en bouillon.

3° Hémocultures. — L'hémoculture, pratiquée sur le vivant ou après la mort, doit, naturellement, être faite aussi stérilement que possible. Nous ensemençons de six à huit tubes de bouillon Martin glucose à 2p. 1000, régénéré par trente minutes d'ébullilion. I )ans chaque tube, on introduit un à deux centimètres cubes de sang et l'on fait le vide aussitôt que possible après l'ensemencement .