TECHNIQUE

Dans notre étude générale de la granulation azurophile. l’instrumentation et la technique dont nous nous sommes servi n'étaient ni nombreuses, ni compliquées. L’instrumentation était réduite à celle qu'on emploie couramment dans tous les laboratoires d’histologie et de physiologie. Les techniques employées sont aussi les techniques générales, histologiques et physiologiques, spécialement celles usitées en hématologie et plus particulièrement celles qui ont été employées dans l'étude de la granulation azurophile. Quélques particularités de ces techniques sont exposées dans ce chapitre dans lequel nous signalerons les préférences que nous avons eues pour quelques-unes d’entre elles.

Nous ajouterons que quelle que soit l'apparente simplicité d'exécution des techniques dont on peut se servir dans cetle étude histologique, nous les avons pratiquées avec un soin spécial, convaincu que nous sommes que l'inobservation de certains détails dans l'exécution, même de détails en apparence insignifiants, peut conduire à des résultats tout à fait différents et parfois faux.

Prélèvement du sang et des liquides séreux.— Nous avons prélevé le sang tantôt par simple piqûre du doigt à sa face dorsale et en arrière de la matrice de l'ongle, en piquant assez profondément avec un vaccinostyle de façon à obtenir

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des gouttes de sang facilement sans avoir besoin de pression ou de ligature quelconque; tantôt par simple piqûre du lobule de l'oreille dans son bord.

Nous avons toujours eu soin, après lavage à l'alcool, de sécher parfaitement la surface du doigt ou de l'oreille d’où devait sortir la goutte de sang parce que, tout insignifiant que ce détail paraisse, le sang s’il se met en contact avec des restes d'alcool ou de sueur, s’hémolyse'en partie ou s’im- -prègne d’impuretés qui plus tard peuvent gêner la coloration et l'examen:

Lorsque nous avons eu besoin d'une quantité de sang plus grande, nous avons recouru à la ponction veineuse en ponchonnant dans une des veines médianes du pli du coude d'après la technique couramment employée. Le sang était recueilli dans une seringue en verre ou dans un tube à essai parfaitement stérilisé.

Pour les liquides séreux (liquide d’hydrocèle, céphalorachidien, ascitique, articulaire, etc.) nous nous sommes servi des mêmes techniques employées couramment.

Comme animaux de laboratoire nous avons utilisé les espèces suivantes : cobaye, lapin, souris blanche, rana escu-

lenta ; nous avons dû recourir à des méthodes spéciales pour

chaque animal utilisé. Pour le cobaye, nous avons fendu légèrement l'oreille, après séchage parfait de sa surface. L'animal est laissé tranquille un instant; les gouttes de sang chez le cobaye doivent sortir spontanément et êbre prélevées immédiatèment, parce que la coagulation se fait très rapidement.

Pour obtenir quelques centimètres cubes de sang de cobaye nous avons pratiqué la ponction du cœur en suivant la technique de Raybaud et Hawthorne : on cherche le bord gauche du sternum à 8-10 millimètres au-dessus du sommet de l'angle formé par la base de l'appendice xyphoïde et le dernier cartilage costal articulé avec le sternum. L'aiguille est enfoncée

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à. 15-17 millimètres au-dessus de la pénultième articulation chondro-sternale en inclinant vers la ligne médiane.

. Chez le lapin nous avons obtenu le sang de la même façon que chez le cobaye et en quantité plus grande en piquant la veine marginale externe de l'oreille après lavoir frottée avec du xylol de façon à produire un afflux de sang.

Chez ces deux animaux, lorsque nous avons eu besoin de faire plusieurs prélèvements, nous avons eu soin de passer d’une oreille à l’autre et toujours en laissant l’animal s’habituer d'abord à son entourage, tout en prenant le sang à la même température, de façon à n'occasionner aucun changement dans sa formule sanguine. |

Chez la souris nous avons obtenu quelques gouttes de sang en sectionnant l'extrémité de sa queue.

Chez la grenouille bien que nous ayons quelquefois obtenu du sang en sectionnant les doigts, nous avons préféré ponctionner la veine faciale comme le conseille Nôller; ce vaisseau facilement accessible donne du sang sans mélange. de lymphe ou d'autres sécrétions; on ponctionne la veine avec une pipette effilée.

Le seul liquide séreux de cobaye dont nous nous sommes -servi est le liquide péritonéal, obtenu par ponction avec une aiguille en platine fine ou avec une effilure de pipette suffisamment résistante; on pratiquait d’abord une petite boutonnière de la peau et de la couche musculaire superticielle.

Examen à l'état frais. — Pour l'examen à l’élat frais nous nous sommes servi de la technique courante el bien connue qui consiste à déposer une goutte de sang entre lame e‘ lamelle bien propres en ayant soin que la goutte ne soil pas trop grosse, de façon que la lamelle ne flotte pas. Le procédé de Biffi est également assez commode. Il consiste à déposer la goutte de sang sur une lamelle, qui est renversée vivement sur une lame sur laquelle on a déposé une goutte d'huile de

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vaseline. En luttant bien à la paraffine, la préparation peut être conservée quelque temps et observée à fort grossissement. |

Pour l'examen à l’élat frais nous avons utilisé le microscope à fond clair, d’ailleurs seulement dans un but d'investigation presqu'empirique, parce qu'il ne nous devait donner aucun résultat.

En nous servant du fond noir {ultra-microscope Leitz, oculaire n° 1) nous avons suivi pour la préparation du sang la

technique déjà exposée par nous dans le Journal du Prati-'

cien, 1916, et qui consiste à prendre avec une pipette effilée à la flamme et chargée d'une petite goutte d'eau distillée, une petite goulte de sang en attendant l'hémolyse des globules rouges el en déposant entre lame et lamelle une goutte de ce mélange. De cette façon les globules blancs sont les seuls visibles dans la préparation et apparaissent nettement et vivants.

Examen à l'état frais après coloration

(coloration vitale).

Nous avons donné une grande importance à cet examen parce qu'il a été employé par plusieurs auteurs dans l'étude de la granulation azurophile. Nous avons suivi. la technique générale de Pappenheim, technique qui consiste à élaler une goutte de colorant employé de la même façon qu'or fait un frottis de sang, sur lame bien propre en la laissant sécher et en mettant ensuite une goutte de sang sur-cette lame ainsi préparée et en le couvrant avec une lamelle de façon que la goutte de sang reste au milieu d'elle et ne dépasse pas les bords. Dans d'autres éas nous nous sommes servi de la - technique de Schilling-Torgau en faisant un frottis dû sang

et en le séchant après la coloration.vitale comme sil S'agis-.

sait d'un frottis sec.

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Les colorants que nous avons employés pour la coloralion vitale sont : le bleu de méthylène à 1 p. 500 d'après la méthode de Sabrazès; le bleu brillant de crezyl; l’azur; le rouge neutre en différentes concentrations (de 1 p. 200 jusqu'à 1 p. 1.000).

Nous avons essayé la solution de May-Grünwald vieille dans laquelle l’alcoo! était évaporé en partie.

En suivant la technique exposée déjà de Pappenheim et après avoir mis la goutte de sang, nous avons fait passer entre la lame et la lamelle une petite goutte d’eau physiologique, d’autres fois de l’eau disüllée. Nous avons obtenu ainsi des résultats tout à fait satisfaisants; les globules blancs résistent et restent vivants pendant un temps plus ou moins long comme avec les autres colorants. Les granulations plasmosomiques {azurophiles?) apparaissent colorées en bleu foncé. :

Examen de frottis humides. — Cet examen parait assez simple, sa technique ne manque pas de présenter quelques difficultés à cause de la fixation des éléments après qu'ils ont été maintenus pendant quelque temps à l'état humide. 11 faut avoir du soin et de la patience si l'on veut obtenir un bon résultat, d'autre part le choix d'un bon fixateur dans ce cas n’est pas facile. La méthode de Weïdenreich dont on ne peut pas dire qu’elle soit commode où facile, ne donne pas toujours les résultats désirés et le sang parait fixé et coloré comme si on l'avait fait sur des frottis desséchés.

Le premier temps, c’est-à-dire la conservation du frotiis humide, ne présente pas de grands inconvénients et seulement au moment de la fixation, comme nous l'avons dit, on peut avoir des insuccès. La méthode simple qui consiste à faire flotter la lame avec le frottis du sang à la surface du fixateur est insuffisante pour obtenir une bonne coloration, et d'autre part on perd beaucoup d'éléments après lavage.

Minsching qui s’est occupé de celte question avec ténacité,

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obtient de bons résultats en ‘effectuant la fixation en deux temps d'après Weidenreich; d’abord le frottis étant fait on plonge immédiatement la lame dans un bocal contenant quelques gouttes d'acide osmique à 4 p. 100 et une goutte d'acide acétique cristallisable; on lave, après avoir laissé le frotlis pendant 30 à 60 secondes dans le flacon bien fermé;

puis on fait une seconde fixation par l'alcool absolu pendant

10 minutes. Cette fixation, qui paraît être appropriée pour la coloration Romanowsky, nous l'avons utilisée, mais elle ne nous à pas salisfait; elle a les mêmes inconvénients que la fixation faite en déposant la lame sur le liquide fixateur, plusieurs éléments ne sont pas colorés et les autres sont déformés. *

Une autre méthode de Minsching (passage rapide des frottis sur lame par différents alcools, sans les laisser sécher, après les avoir fixés humides par le sublimé ou par le fixateur de Mann) réussit bien. lorsque la coloration se fait par l’hématoxyline ferrique; mais dans notre étude cela ne peut pas avoir lieu.

Nous avons adopté le procédé de Moëwe, qui est uné modification de la méthode d'Altmann: et de la méthode de

Schride, pour l'étude des mitochondries, toutefois au lieu d'employer la boîte en fer blanc de Moewe, nous avons pris une chambre humide dans laquelle nous avons mis une solution de chlorure de sodium à 8 p. 1.000 de la même façon que lui, et en quantité suffisante pour que la lame avec le frotus de sang placée sur les divisions les plus basses d’une échelle vienne en contact avec la solution salée.

Les plateaux contenant le liquide et l'échelle recouverts de la cloche de la chambre humide sont mis à l’étuve à 37 degrés pendant un quart d'heure ou une demi-heure. Pour avoir un bon résullat nous avons eu soin de ne pas faire le frottis du sang trop épais et de le mettre immédiatement en contact avee “la solution chlorurée. Nous avons préparé d'avance un liquide

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