RÉACTION DES MEMBRANES LIGNIFIÉES

Les réactions que l’on a indiquées, pour caractériser les tissus ligneux, sont excessivement nombreuses. Nous ne mentionnerons que les principales.

Le bois se colore d'une façon intense avec une solution aqueuse ou alcoolique de beaucoup de phénols, en présence de l'acide chlorhydrique concentré. Ces réactions sont les suivantes :

Phenot AE Coloration obtenue vert bleu (RunGe) (86), TiEMANN-HAARmANN (46). Phloroglucine. — rouge violet (WIEsNER) (37). Résorcine . . . — violet (WIESNER).

Orcine ete, — rouge violet (LirPMANN) (39).

Pyrocatéchine. — bleu verdâtre (WVïEsNER, Iur) (80). Naphtol.... — verdâtre (TuL).

RRULO LEE - vert.

PITOLMRETESES | — rouge cerise (BAEYER, N1GGL) (40). DÉAEOI 3 AIN rouge cerise (MATTIROLO) (44). Garbazol.…. rouge cerise (MATTIROLO).

PNPOLE RES — rouge.

L'addition de chlorate de potassium renforce souvent le ton. Tommasi (42), Mouiscn (27).

Une deuxième série de réactions de la lignine est obtenue avec un grand nombre d'amines aromatiques, en solution neutre ou acidulée, etdonne à lamembrane une teinte jaune. Parmi ces réactions il yena de très anciennement connues, Ce sont surtout les sels d'aniline,et notamment le sulfate d'aniline [RuNGE (l..c.), Scaaprin-

Cadii MRNASS (4 Pr TE +

nr re

Gex (48), Wiesner (38), V. Honner (19), la paratoluidine [SINGER (24)};la tylidine, la métaphénylendiamine [Mousen (28)]. Le sulfate de thalline, indiqué par Hecrer (81), donne aussi une coloration jaune.

À ces réactifs, il faut en ajouter quelques-uns couramment employés dans les laboratoires et qui colorent non seulement les membranes lignifiées, mais encore les tissus subérifiés et cutinisés, comme le vert d'iode, combiné généralement avec le carmin aluné de Grenacher, la fuchsine ammoniacale. Enfin, on se sert quelquefois de réactifs minéraux,et parmi eux je cite le réactif de Maure (44), introduit depuis très peu de temps en micrographie. Cette réaction consiste à traiter les coupes par le permanganate de potassium et par l'acide chlorhydrique et à les soumettre ensuite à l'action de lammoniaque. Les parois lignifiées seulement prennent alors une teinte rouge,comparable à celle de la fuchsine,ou mieux encore à celle de la phloroglucine.

Tous ces réactifs, très souvent indifféremment employés pour rendre les coupes plus lisibles, sont loin d'agir de la même manière sur les tissus lignifiés, ainsi que l’a récemment montré GENEAU DE LAMARLIÈRE (84).

A ce point de vue, on peut les diviser en trois groupes que nous étudierons successivement. Nous prendrons comme types du premier groupe (groupe À) la phloroglucine et le sulfate d'aniline ; comme types du second (groupe B), le vert d'iode et la fuchsine ammoniacale. Nous y ajouterons l'iode en solution (teinture d'iode), qui est aussi un réactif du bois, bien qu'on l'emploie moins fréquemment que les deux autres, dans un troisième groupe enfin (groupe C), nous étudierons le réactif de MauLe.

Groupe A

Lorsqu'on traite un tissu ligneux par l'action combinée de la phloroglucine et de l'acide chlorhydrique, il se fait, comme on la dit, une belle coloration rouge cerise.

Il est bon de remarquer tout d'abord que, dans bien des cas, 1l n'est pas nécessaire d'ajouter de la phloroglucine pour obtenir cette réaction, et l’acide chlorhydrique employé seul suffit. Ce fait, qui paraît surprenant au premier abord, s'explique aisément lorsqu'on tient compte qu'il y a très souvent de la phloroglucine, dans les

lissus, comme l'a signalé Tscuirce (45, 175). Waace (46), qui à fait une longue étude sur la répartition de cette substance chez les végétaux, a montré d'abord qu'elle y est extrêmement répandue, et qu'on la rencontre notamment dans le parenchyme cortical, surtout dans sa partie externe, dans le sclérenchyme, l'endoderme, les parois du liège mort, le parenchyme ligneux, les vaisseaux et les fibres du bois, le cambium, au niveau des rayons médullaires, les rayons médullaires. Les fibres libériennes, au contraire, et les tubes criblés en sont généralement dépourvus. Pour la moelle, les cas sont très variables.

Ainsi donc, les éléments lignifiés voisins d'une région à phloroglucine se coloreront instantanément en rouge, par addition pure et simple d'acide chlorhydrique.

Cette restriction étant faite, il est important de rechercher de quelle façon se produit la réaction, suivant les conditions d'expérience.

Avant d'employer les réactifs, on soumet généralement les coupes à l'action de l'hypochlorite de potassium ou eau de Javel, pour débarrasser les cellules des matières albuminoïdes qu'elles renferment, en d'autres termes, pour nettoyer les Lissus et les rendre plus transparents. Cette action ne doit pas durer plus d’un quart d'heure.

Dans ces conditions, les réactifs tels que la phloroglucine ou le sulfate d’aniline et corps similaires, dont nous avons donné la liste plus haut, se fixent sur les membranes lignifiées ; seules ces membranes sont colorées. Les parois subérifiées ou cutinisées restent incolores, à moins cependant qu'elles ne contiennent de la lignine dans quelques-unes de leurs parties ; il n’est pas rare, par exemple, que la lamelle moyenne du liège soit lignifiée.

Dans les amas de fibres, on voit très distinctement la lamelle moyenne toujours colorée d'une façon très intense, la couche secondaire colorée aussi, quoiqu'un peu plus faiblement ; la couche tertiaire, cellulosique comme on sait, à peine teintée et souvent même tout à fait incolore.

Mais si l'on prolonge pendant un certain Lemps l’action de l’hypochlorite, on voit les réactions s'atlénuer peu à peu, et lorsque le contact avec l'eau de Javel a duré 5 à 6 heures, on ne peut plus faire apparaître aucune coloration.

Les choses se passent de la même façon, si on remplace, comme agent oxydant, l'eau de Javel par l'acide mitrique, l'acide chromique ou le liquide d'Hormeisrer (solution saturée de chlorate de

potassium dans laquelle on verse de l'acide chlorhydrique étendu d'eau).

Groupe B

Il n'en va pas de même avec les réactifs comme le vert d'iode ou la fuchsine ammoniacale. Ces colorants diffèrent d'abord des précédents en ce qu'ils ne sont pas spéciaux aux tissus lignifiés, puisqu'ils se fixent aussi sur les membranes subérifiées et cutinisées.

Je passe sur les nuances spéciales qu'ils donnent à certains éléments du bois, sur l'intensité de la coloration qui, exaltée danstelle région d'une coupe, se trouvera affaiblie dans une autre.

On observe à ce point de vue une certaine discordance avec les effets obtenus par la phloroglucine.

Mais là où la différence est surtout frappante, c'est lorsqu'on fait agir les réactifs après un long traitement par les oxydants. Tandis que les réactions de la phloroglucine ou du sulfate d'aniline cessent de se produire au bout de quelques heures, le vert d'iode, la fuchsine ammoniacale ou la teinture d'iode diluée, continuent à colorer les tissus.

Après 10 ou 15 heures d'oxydation, le vert d'iode, par exemple, est fixé encore avec intensité. On constate simplement que, de verte qu'elle était, la coloration a viré au bleu. Bien plus, le liège et la cuticule, qui ne se colorent que faiblement, en général, dans le début, prennent des teintes de plus en plus vives à mesure que l'oxydation avance.

Si on prolonge enfin le traitement pendant 24 heures, les membranes ne se teignent plus par les réactifs ci-dessus, mais se montrent sensibles aux réactifs de la cellulose. C'est ainsi, par exemple, que si on a fait usage,pour suivre ces expériences, du vert d'iode uni au carmin aluné,on observe ce faitintéressantqu’à partir du moment où les parois cellulaires ne se colorent plus par le vert d'iode, elles prennent la coloration rouge du carmin.

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Groupe C

La réaction de MauLe consiste, comme on l'a vu, à traiter d'abord les membranes par le permanganate de potassium, puis successivement par l'acide chlorhydrique et l'ammoniaque.

Les tissus sont oxydés dans le premier temps de la réaction, où le permanganate peut, d'ailleurs, être remplacé par un autre oxydant comme l'acide chromique ou le liquide d'Hormeisrer. C'est le produit oxydé que l'ammoniaque colore en rouge.

Nous pouvons maintenant tirer les déductions suivantes des expériences qui précèdent :

On peut considérer que, dans l'oxydation des tissus lignifiés, que ce soit par l'hypochlorite ou par le permanganate (réaction de Mauze), c'est la lignine qui s'oxyde (c'est-à-dire sans doute l'hadromal de Czareck). La preuve en est que la membrane ainsi délignifiée ne se colore plus par la phloroglucine. 4

Les produits d'oxydation sont des acides résineux déjà entrevus par FRÉNY.

Si les colorations au vert d'iode, à la fuchsine ammoniacale ou à la teinture d'iode se manifestent encore après oxydation, c’est qu'elles portent sur d’autres substances de la membrane que la lignine Etant donné que ces réactifs sont précisément ceux aussi des matières azolées (noyau, protoplasme), il est permis de penser qu'ils se fixent sur les substances azotées incluses dans la membrane lignifiée. C'est dans les mêmes conditions qu'ils colorent aussi les membranes subérifiées ou cutinisées.

En résumé, par conséquent, la membrane lignifiée est colorée par des réactifs nombreux agissant seulement sur certaines de ses parties constituantes.

Les réactifs du groupe A (phloroglucine chlorhydrique, sulfate d'aniline) se fixent sur la lignine (ou hadromal) et seulement sur cette substance ;

Les réactifs du groupe B (vert d'iode, fuchsine ammoniacale) ne se fixent vraisemblablement que sur les matières azotées ;

Les réactifs du groupe C (réactif de Maure) ne colorent la mem-

brane que lorsqu'elle est délignifiée, c'est-à-dire après oxydation de la lignine.

TECHNIQUE

PHLOROGLUCINE CHLORHYDRIQUE

On dépose la coupe sur un porte-objet, dans une goutte d'une solution alcoolique de phloroglucine Après quelque temps, lorsque l'alcool est dilué, on recouvre la coupe avec de l'acide chlorhydrique concentré, Tous les éléments lignifiés se sont colorés en rouge, les autres sont restés incolores.