I - LE DOSAGE DU GLYCOGENE CARDIAQUE

Nous avons signalé dans l'étude consacrée aux variations du taux du glycogène cardiaque que le dosage de ce composé a été souvent pratiqué dans des conditions qui laissent place à quelques doutes sur la validité des résultats obtenus. En effet, si le dosage du glycogène, par voie chimique, ne comporte que des opérations relativemænt simples, la conduite de l'analyse, dans le cas du tissu cardiaque, exige quelques précautions sans lesquelles une partie considérable de l'hydrate de carbone disparaît, par hydrolyse spontanée, au cours des premiers stades de l'analyse, ce qui conduit à des résultats systématiquement faibles .

Le problème du dosage du glycogène cardiaque comprend deux éléments 3: d'une part, celui du dosage proprement dit de l'hydrate de carbone, d'autre part, celui des moyens à employer pour fixer la totalité du glycogène présent dans le

tissu, au moment de l'expérience.

A .- Le dosage chimique du glycogène tissulaire .

Le premier procédé valable de dosage du glycogène dans les tissus a été proposé par KULZ (114), en 1886. Le principe de ce dosage a été repris et sa technique perfectionnée par PFLUGER (392), en une méthode qui est devenue classique et a-plus ou moins- servi de base à toutes les techniques ultérieures +. Les étapes en sont les suivantes +: dissolution du tissu dans une lessive de potasse à 60%, à l'ébullition ; précipitation par l'alcool éthylique à 95% ; dissolution du précipité dans l'eau ; hydrolyse par l'acide chlorhydrique à chaud, et dosage du sucre formé par une méthode au cuivre du type de la méthode de Bertrand. Nous ferons, d'abord une revue rapide des principales modifications qui ont été apportées par divers auteurs à chacune des étapes de cette détermination.

a) Dissolution du tissu .

Elle se fait presque toujours dans une lessive de potasse à l'ébullition. Cependant, pour des cas particuliers, CALDERWOOD & ARMSTRONG (393) ont préconisé l'emploi d'une lessive de soude à la température de 80 degrés. Notre expérience personnelle nous a montré qu'il y a peu de différence entre ces deux bases, la potasse ayant, cependant une agressivité plus grande, ce qui permet d'abréger un peu la durée de cette première phase. On obtient, finalement, une liqueur plus ou moins limpide ; PFLUGER prétend qu'il est impossible d'éviter la formation de légers flocons persistants -ce que nous avons pu, également, cons tater- et recommande donc, de filtrer la solution ainsi obtenw .

Quant au titre de la solution alcaline à utiliser, il varie beaucoup d'un auteur à l'autre. PFLUGER traite 100 g. de broyat d'organe par 100 ce de lessive de potasse à 6%, ce qui représente, donc, une liqueur contenant environ 30 g. de potasse pour 100 ; HEDON et LOUBATIERES (394), utilisant une technique antérieurement mise au point par CHAIGNE (395) utilisent pour 1 g. de tissu, 1 ce de potasse à 40%, soit un titre final de 20% ; BIERRY & GRUZEWSKA (396) partent de potasse à 35% pour aboutir à un titre final de 15% environ ; GOOD, KRAMER et SOMOGYI (397) traitent 1 g. de tissu par 2 ce de potasse à 30% : titre final 20% ; EVANS (47), enfin, partant de 2 ce de potasse à 30%, amène, avant la précipitation, le volume de la solution à 6 cc, c'est à dire à un titre de 1%.

La dissolution du tissu se fait, généralement, au bain-marie bouillant, et dure de 5C minutes à 2 heures, suivant les auteurs. Les techniques de dissolution à l'autoclave à 120°, telles que celles de BIERRY & GRUZEWSKA (396) et BIERRY, GOUZON et MAGNAN (397), sont actuellement à peu près abandonnées.

À la fin de cette première étape du dosage, on dispose donc d'une solution contenant la totalité du tissu dans une lessive alchline à un titre qui varie, selon les auteurs de 100 à 500 g. par litre .

b) Précipitation du glycogène.

La précipitation du glycogène de la solution alcaline se fait par l'al-

cool éthylique . Trois facteurs sont, ici, à considérer ; le temps nécessaire à

la précipitation complète du glycogène, la concentration finale du milieu en

alcool, la concentration du milieu en alcali.

En ce qui concerne le taux de la potasse dans le milieu de précipitation, tous les auteurs, -à l'exception de HOLMES ET HOLMES (398) qui conservent un taux final de potasse de 30/- considèrent qu'il y a lieu d'éviter des concentrations trop fortes en alcali, Aussi, dilue-t-on généralement la liqueur potas- Sique avant de la traiter par l'alcool ; on obtient ainsi des liqueurs dont les concentrations en potasse sont inférieures à 15%, (PFLUGER : 15% — GOOD, KRAHER & SOMOGYI : 10% - CHAIGNE : 15% — EVANS : 6% - etc.). L'alcool est alors ajouté en quantité telle que sa concentration finale soit voisine de 65% . KERLY (399) a montré que la solubilité du glycogène dans l'alcool ne permet pas de descendre bien au-dessous de cette concentration. La précipitation se fait généralement à froid, en une dizaine d'heures, bien qu'un certain nombre d'auteurs réduisent ce temps à une trentaine de minutes en utilisant l'alcool à chaud (GO0D, KRAMER & SOMOGYI -397, SASS - KORTSAK, WANG & VERZAR -311).

On obtient, finalement, un précipité floconneux de glycogène qu'on sépare facilement par centrifugation et qui se présente, alors, comme une masse blanc jaunâêtre adhérant bien au fond du tube. Les méthodes diffèrent considéraee. quant aux traitements à faire subir à ce culot de glycogène pour le purifier.

Notons enfin, que quelques auteurs ne jugent pas nécessaire de séparer le glycogène de la solution potassique ; ils suppriment donc la précipitation par l'alcool et dosent directement le glycogène en solution dans la lessive alcaline (BIERRY & GOUZON -400),

c) Purification du précipité de glycogène.

Quand on considère l'ensemble des méthodes de dosage du glycogène qui ont été successivement proposées on peut dire qu'après une période où la tendance a été de chercher à obtenir un précipité de glycogène aussi pur que possible on admet plutôt aujourd'hui que presque toutes les substances réductrices (qui seraient ultérieurement susceptibles d'être dosées comme glucose) sont solubles dans l'alcool et donc éliminées lors de la séparation du précipité de glycogène.

Dans la méthode initiale de PFLUGER (392), on se contente de redissoudre le précipité de glycogène dans l'eau froide, après l'avoir lavé à l'alcool ; les impuretés qui ont été entrainées lors de la précipitation sont insolubles et sont éliminées par filtration. Dans les techniques qui ont été proposées comme améliorations de celle de PFLUGER, on multiplie, généralement, le nombre des lavages à l'alcool : trois (CHAIGNE -395), ou quatre (SLOSSE -401, CALDERWOOD & ARMSTRONG -393). Il semble que dans les méthodes récentes, on ait plus ou moins renoncé à ces séries de mises en suspension suivies de centrifugation ou de filtration qui augmentent les occasions de pertes de matière : VAN WAGTENDONK, SIMONSEN et HACKETT (402) se limitent à un lavage, GOOD, KRAMER et SOMOGYI (397) et EVANS (47) ne lavent pas le précipité. Quelques auteurs, au contraire, se sont attachés à obtenir par des séries de reprises des précipités dans l'eau, suivies de nouvelles précipitations alcooliques, un précipité de glycogène aussi pur que possible (SASS - KORTSAK, WANG & VERZAR -311).

d) Dosage du glycogène.

Dans la plupart des méthodes, on dose la quantité de glycogène obtenue à et éventuellement purifiée- comme il vient d'être dit, sous forme de sucre après une hydrolyse acide, à chaud. Cependant, DE JONGH & PLANELLES (403) se contentent

de mettre en suspension le précipité de glycogène dans un mélange alcool-éther et |

d'estimer la quantité du glycogène par néphélométrie ; quant à VAN WAGTENDONK , SI- MONSEN et HACKETT (402), ils dissolvent ce précipité dans l'eau chaude, ajustent à un volume donné et colorent la liqueur ainsi obtenue par une solution étalon d'iode dans l'iodure de potassium : le dosage se fait par appréciation colorimétrique de la teinte brune obtenue. Signalons enfin, qu'actuellement, les méthodes de ce type connaissent une grande faveur à la suite des travaux sur le dosage colorimétrique des hydrates de carbone par l'anthrone (DREYWOOD -—404, VILES & SIL- VERMAN -405, MORRIS -406, SEIFTER, DAYTON, NOVIC & MUNTWYLER -407) qui, bien qu'elles soient un peu moins précises que les méthodes par hydrolyse, présentent l'avantage d'être beaucoup plus rapides.

Dans les méthodes par hydrolyse, le précipité de glycogène, séparé par centrifugation et séché, est traité par un volume variant de 2 à 10 ce d'acide chlorhydrique 0.7 N, au bain-marie bouillant. L'acide chlorhydrique peut être remplacé par l'acide sulfurique normal ; les hydrolyses à l'autoclave (BIERRY & GRUZEWSKA -396) sont actuellement abandonnées.

L'hydrolyse dure de 2 heures 50 à 4 heures. Au bout de ce temps, la liqueur est refroidie, neutralisée et le sucre formé est dosé par une méthode qui est, en général, celle d'HAGEDORN - JENSEN (408, 409). De nombreuses autres mé-: thodes ont été employées. GOOD, KRAÏER et SOMOGYI (397) recommandent d'utiliser, de préférence, pour ce dosage, les méthodes au cuivre du type SHAFFER - HARTMANN (410,411) ou SOMOGYI (412). Ces recommandations ont été reprises et justifiées par BIERRY, GOUZON et MAGNAN (413). Les auteurs anglo-saxons donnent actuellement leur préférence, pour ce dosage, à la méthode de NELSON (414).

Le poids du glycogène hydrolisé est égal à celui du sucre formé multiplié par le facteur 0.927.

Quelques auteurs ont indiqué la dispersion de leurs résultats expérimentaux, Malheureusement, les procédés de notation sont extrêmement variables et ne sont souvent pas définis. En dehors du calcul de l'écart-type, un certain nombre d'auteurs définissent la précision de leurs résultats par le calcul de l'erreur probable, égale à 0,6745 fois l'écart-type (VISSCHER & MULDER -415).

B.- Le dosage des formes du glycogène cardiaque.

La première distinction qui a pu être établie entre les formes libre et liée du glycogène tissulaire repose sur leur inégale facilité d'extraction du tissu dans lequel elles se trouvent engagées, (KULZ -114). WILLSTATTER & RHODE- WALD (115) ont tenté d'extraire le lyo-glycogène par l'acide trichloracétique à 27, le glycogène total étant dosé par la méthode de PFLÜGER (392). AUBEL, REICH et LANG (416), étudiant la répartition des formes du glycogène dans le foie du chien, extraient le glycogène soluble par le sulfate d'ammonium et dosent le glycogène lié, sur le culot, après dissolution dans la potasse à 354, à chaud, WAJZER (120) a considérablement simplifié la méthode ; le muscle est broyé dans

l'acide trichloracétique refroidi; le lyo-glycogène passe en solution dens l'acide, le desmo-glycogène reste lié aux proteines et se trouve précipité en même temps qu'elles : la centrifugation permet de séparer les deux formes, Il apparait, cependant, que si cette méthode est satisfaisante lorsqu'il s'agit du foie Où la réserve de glycogène est relativement stable- il n'en va plus de même dans le cas du muscle où des précautions spéciales doivent être prises pour éviter toute glycogènolyse spontanée au cours des manipulations, Il est nécessaire, en particulier, d'assurer des conditions de refroidissement et de rapidité des opérations telles qu'en ont réalisé, par exemple, BIOOM, LEWIS, SCHUMPERT & CHEN (T21) dont la méthode se distingue, en outre, de celle de WAJZER par le fait qu'au lieu de doser séparément le lyo- et le desmo-glycogène et de déterminer le glycogène total par addition, on dose séparément le lyo-glycogène et le glycogène total, le desmo-glycogène étant connu par différence.