ISOLEMENT DU VIRUS

Pour considérer que l'isolement d'un virus €. à partir d'un

matériel donné, a réussi, il faut :

1° Que l'inoculation pratiquée avec ce matériel, provoque chez les souriceaux une malade typique avec des lésions anatomo-

pathologiques spécifiques ;

2° Que l'on puisse reproduire la maladie expérimentale plu-

sieurs fois à partir du même matériel de départ ;

3° Que le sérum du patient prélevé à la phase de convalescence, neutralise l'agent isolé, ou mieux, que l'on puisse mettre en évidence l'apparition ou l'augmentation du taux des anti-

COrpPS ;

4° Que le virus isolé puisse être passé en série sur l'animal en donnant chaque fois les lésions typiques (la symptomatologie

pouvant elle-même changer par l'adaptation à l'animal).

C'est à partir des selles que se pratique le plus couramment l'isolement des virus C.: Voici quelle est la technique employée dans le service des virus de l'Institut Pasteur.

Les selles sont prélevées dans un récipient à large ouverture et hermétiquement clos. Dès leur réception, elles sont enregistrées, étiquetées et conservées dans une glacière à +206 jusqu'à leur utilisation. À ce moment, environ 5 grammes de matières sont prélevés et broyés dans un mortier avec de l'eau physio-

logique, jusqu'à un volume total de 50 cc. L'émulsion est alors

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placée dans un flacon à billes et gardée à la glacière à 4° pendant 24 heures, en agitant fréquemment. On prélève le liquide et on le centrifuge à 4.000 tours/minute pendant 20 minutes. Le surnageant est ensuite prélevé et additionné de 1/3 d'éther. On mélange soigneusement puis on décante avec un entonnoir à boule dans un flacon à billes que l'on porte sous une cloche à vide pour évaporer l'éther jusqu'à ce que le liquide ne boue plus. Le liquide est ensuite prélevé et mis dans des tubes en lustéroide préalablement stérilisés aux ultra-violets, puis centrifugé à froid pendant une heure à 5.000 tours/minute. Le surnageant est prélevé dans un récipient et placé dans une cloche à vide que l'on garde à la glacière jusqu'à ce que le volume soit réduit à 5 cc. environ ; si la dessication est complète, on redissout dans 5 cc. d'eau distillée. Après avoir ajouté 100 unités de pénicilline et 5 mmg. de streptomycine par centicube, des cultures de contrôle aérobies et anaérobies sont pratiquées. Si ces cultures s'avèrent positives, on peut soit rajouter des antibiotiques, soit filtrer sur bougie jusqu à stérilité bacté-

rienne totale. L'extrait est alors prêt à être inoculé.

L'inoculation des selles ainsi traitées se fait sur des souris de 48 heures environ. Les souriceaux et leur mère sont isolés dans un cristallisoir contenant de la sciure et du coton. La suspension peut être inoculée par voie intra-cérébrale, intra-péritonéale ou sous-cutanée. C'est cette dernière que nous préférons, car entre les omoplates il est facile d'injecter jusqu'à 0,1 cc. sans que, le matériel ne ressorte en partie, comme cela se produit souvent par voie intra-péritonéale. Les animaux sont alors observés plusieurs fois par jour pendant 3 semaines environ ; ceux qui meu:ent avant 24 heures sont éliminés. Après ce laps de temps, quand ils montrent des signes de paralysie ou succombent, les souriceaux sont pelés, éviscérés, mis en tubes scellés et étiquetés puis conservés à la glacière à — 20°. B'en entendu à chaque fois, des examens histologiques de contrôle et des passages sur

de nouvelles portées sont pratiqués.

Titrage du virus

Les souriceaux stockés sont pesés puis broyés dans un mortier de grandes dimensions, préalablement refroidi, ainsi que le pilon, à — 20°. En écrasant rapidement les tissus contre la paroi, de façon qu'ils se congèlent en couche mince, on obtient un broyat très fin avec lequel est pratiquée une suspension en général à 10 % ; l'ensemble est ensuite laissé une nuit à la glacière à 4°, Le lendemain la suspension est centrifugée à froid, 15 minutes à 3.000 tours/minute, et le surnageant est prélevé. Après adjonction d'antibiotiques, des cultures de contrôle sont pratiquées et la suspension peut être conservée à — 20° sans baisse de titre jusqu'à la titration proprement dite. Pour celle-ci, on s'est assuré au préalable un nombre suffisant de portées, toutes du même âge, qui sont mélangées puis redistribuées par groupes de 5 souriceaux. Chaque groupe ainsi qu'une mère, est placé dans un cristallisoir différent. On pratique alors des dilutions à 10-1, 10-2... 10-" de la suspension primitive, chaque dilution correspondant à un groupe de souriceaux. Ceux-ci sont alors inoculés avec une même quantité de matériel, en général 0,1 cc. puis observés pendant 3 semaines environ. Le nombre d'animaux morts dans chaque groupe est noté et la dose infectieuse 50 % est ensuite déterminée par la méthode des totaux cumulatifs de REED et MuENcH (232) en se référant à des tables préalablement établies (P. LÉPINE in 164, page 1666).