PURIFICATION DES VIRUS C

De nombreux auteurs se sont attachés à la purification des virus C., la plupart du temps dans le but de préparer des antigènes pour la déviation du complément, mais aussi pour l'étude du virus au microscope électronique. Partant d'un matériel aussi complexe qu'un broyat de souriceaux, il faut dans un premier temps en extraire le virus et dans un deuxième temps, se débarrasser des diverses substances, lipides, protéines, lipo-protéines

qui ont été entraînées.

Extraction

La plupart des auteurs procèdent à une extraction en milieu aqueux de constitution variable. CONTRERAS et MELNICK notamment, semblent avoir adopté l'eau distillée (34-35-36), précédemment ils avaient utilisé l'eau physiologique et le tampon au véronal. Quel que soit le liquide employé, le pH est toujours

voisin de 7,4 et la concentration saline de 0,15.

Nous avons, au cours d'une étude exécutée dans le service des virus du Professeur LÉPINE, en collaboration avec P. SLIZEWICZ, comparé la teneur en protéines de différentes extractions pratiquées avec des solutions de pH et de concentration saline variables. Cette étude non encore publiée, nous a montré que l'extraction des protéines était beaucoup plus fonction de M (concentration saline) que du pH et qu'elle est plus importante à M élevé (1,5) qu'à M faible (0,15). Le matériel virulent manifeste un pouvoir tampon élevé et d'autant plus que l'on s'éloigne de pH 7. Lorsque le pH varie, l'extraction des protéines se fait mieux à pH élevé.

En étudiant plus particulièrement des extractions dans l'eau distillée et le tampon au véronal, nous avons obtenu avec ce dernier une teneur en protéines ainsi qu'un pouvoir virulent plus élevés ([D*° de 10-$,° pour 10-7, dans l'eau distillée).

Be

Purification

On peut se débarrasser des grosses particules par des centrifugations successives et tenter de sédimenter le virus par ultracentrifugation ; cette technique a été employée par la plupart des auteurs, mais n’élimine pas une grande quantité de facteurs étrangers de petite taille, lipides, protéines et lipoprotéines. Les congélations et décongélations successives, précipitent une certaine partie des protéines, mais ce n'est qu'un adjuvant à des méthodes plus efficaces qui tendent, soit à précipiter électivement le virus comme le méthanol à concentrations décroissantes suivant la méthode de PoLLARD utilisée par QuiGLey (227), soit à précipiter les protéines étrangères en laissant le virus en suspension. C'est cette dernière technique qui a actuellement le plus de faveur. R.L. Donp (73), emploie une solution à 0,5 % d'urate de potasse ; MELNICK et ses collaborateurs (34, 35, 145, 191, 192, 194), ainsi que BRIEFS et ses collaborateurs (15), ont employé la méthode de WaRREN (280), en utilisant 5 mmg. de sulfate de Protamine par centicube de suspension à 10 %. BRIEFS et ses collaborateurs, pour une étude au microscope électronique, ont utilisé une digestion préalable par la trypsine cristallisée deux fois, en solution à 0,1 % pendant 2 heures AT ULS ;

Dans le but de préparer des antigènes pour la déviation du complément, nous avons utilisé une méthode de précipitation par le Sulfate de Protamine, 1 cgr. par gramme de souriceau employé, suivie d'un traitement à l'éther refroidi, qui nous a donné des résultats satisfaisants (69). Nous avons poussé plus loin les essais de purification en vue de l'étude de la souche France 50-358 (antig. comparable à Albany À, type 2) au microscope électronique. Dans une première expérience, l'extraction par du tampon au véronal fut traitée par le sulfate de protamine, puis soumise à 6 extractions successives par l'éther froid suivant la méthode déjà décrite (69). La suspension fut

alors débarrassée de l'éther restant, sous cloche à vide, puis

centrifugée à froid à 23.000 tm. pendant une heure (30.000 Xg. fond tube). Le surnageant fut alors ultra-centrifugé de façon à obtenir une accélération de plus de 100.000Xg. fond tube, puis le culot remis en suspension après avoir éliminé la plus grande part du liquide surnageant, fut mis en présence d'hématies de poule lysées par la saponine suivant la technique de CarLisLE (23). L'idée directrice était de voir si les virus C. peuvent être adsorbés par ces stromas. Les photographies exécutées au microscope électronique par M" ©. CROISSANT, ne montrèrent pas de particules de virus à la surface des stromas, par contre, le liquide révéla la présence de corpuscules sphériques d'une taille avoisinant 30 millimicrons et présentant les caractères du virus C. tels qu'ils ont été décrits par BRIEFS et ses col-

laborateurs (15).

Fig. 1: Virus Coxsackie France 50-358 purifié (Microscope électronique, grossissement X63.000. Service des Virus de l'Institut Pasteur).

Syrie

En collaboration avec P. SriZEWICZ, nous avons repris cette étude lors du travail cité plus haut en même temps que nous comparions la purfication d'extractions dans des solutions de pH et de concentrations salines variables, ainsi que dans l'eau distillée et le tampon au véronal.Nous avons déjà vu que la quantité de protéines extraite était plus élevée à forte concentration saline (M. 1,5). Cependant la précipitation par le sulfate de protamine s'avéra plus faible à M. 1,5 qu'à M. 0,15. Ce résultat semble paradoxal et nous en avons conclu à un déséquilibre entre la quantité de protéines extraite et celle de sulfate de protamine employée, qui aurait empêché celui-ci d'agir. Cette opinion a été renforcée par la mise en évidence d'un fort pouvoir anti-complémentaire dans ces solutions, vraisemblablement dû au restant de sulfate de protamine. Au contraire, les extractions à concentration saline faible de M. 0,15, bien que la quantité de protéines extraite ait été plus faible, présentèrent un précipité abondant et les solutions obtenues n'avaient pas de pouvoir anti-

complémentaire.

L'influence du pH a paru différente suivant la concentration saline : à M. 0,15 le précipité était d'autant plus abondant que le pH était plus près de 7 et l'inverse pour M. 1,5.

À la suite de ces constatations, il nous semble préférable d'utiliser des solutions extractives ayant une concentration saline

de M. 0,15 et de pH voisin de 7.

C'est pourquoi dans une deuxième expérience, nous avons étudié la purification par la protamine-éther d'extractions pratiquées avec le tampon au véronal (pH 7,3 et M. 0,15) en les opposant à celles obtenues avec l'eau distillée. Après chaque opération, le titre des protéines et de la virulence fut établi pour chacune des solutions, le taux de nrotéines de la première extraction étant considéré comme base 100 %. Les résultats sont résumés

dans le tableau suivant (Tableau Î) :

SDS NES