TECHNIQUE
a) Recherche et examen des poils parasités.
En s’aidant de la loupe d’horloger, dilacérer les croûtes avec la pince et l'aiguille lancéolée.
Le poil atteint de teigne est généralement enrobé dans les croûtes. On le reconnaît facilement à son aspect tordu et à la présence d’une mince pellicule farineuse qui ne doit pas être confondue avec la gaine que forment parfois les squames. Il est facile de faire cette différenciation : la pellicule farineuse formée par les spores du champignon reste adhérente au poil, alors que les squames s’en détachent facilement par simple frottement, sous l’action de l'aiguille lancéolée.
Les poils parasités isolés sont disposés, au nombre d’une douzaine, sur une des lames flambées. Prendre au hasard 4 ou 5 de ces poils et les placer sur une autre lame flambée, dans une goutte de chloral-lactophénol. Les ranger parallèlement avec une aiguille droite et recouvrir d’une lamelle.
Examiner au microscope au faible grossissement d’abord et à un grossissement plus fort ensuite. Par exemple, avec un microscope Stiassnie, opérer d'abord avec l'objectif 4 et l’oculaire 4 {X 83) et observer ensuite avec l'objectif 7 et l’oculaire 4 (x 340).
Noter, au cours de cet examen, si l’envahissement a les caractères de la microsporie, des microïdes, ou des Trichophyton mégasporés.
La découverte du parasite confirme que les poils ont été bien choisis et que l’ensemencement peut être pratiqué avec des chances de succès. |
Si l'examen a été négatif, le renouveler deux fois pour éviter toute erreur.
Toutefois, chez le cheval, si la lésion est récente, les poils parasités sont peu nombreux. D'autre part, l'expérience m'a montré qu'on ne trouve presque jamais de poils parasités lorsque le champignon appartient à une espèce rarement rencontrée chez les
équidés : Clénomyces asleroïdes, Sabouraudites gypseus, Trichophyton ochraceum.
Même si l'examen des poils est négatif, l'ensemencement doit être pratiqué en partant des poils qui paraissent déformés au niveau de la racine.
b) Préparation des parcelles de poils à ensemencer. Flamber à nouveau la pince et l'aiguille lancéolée.
Choisir à la loupe les plus atteints des poils parasités isolés qui restent sur la lame et les couper avec l'aiguille lancéolée.
La parcelle du poil coupée doit être assez petite et avoir à peine 0 mm. 5 de longueur. Si l’on pratique la section d’un poil parasité, celui-ci offre peu de résistance et on a la sensation de couper un tissu mou. Par contre, si le poil n’es£ pas envahi par le champignon, ou commence seulement à être atteint, il est résistant, la section fait un bruit sec et fréquemment la parcelle saute en dehors de la lame et même de la table en cuivre.
Les parcelles coupées sont portées sur la dernière lame flambée disponible et rangées les unes à côté des autres. Couper 10 à 15 parcelles.
c) Ensemencement sur gélose inclinée.
L’ensemencement sur gélose inclinée se pratique avec une pipette dont l’extrémité effilée a été préparée de façon à présenter une petite boule de verre de la grosseur d’un grain de millet.
Flamber la partie effilée de la pipette et laisser refroidir. Après avoir débouché le tube et flambé l’ouverture, toucher l’eau de condensation au fond du tube avec l'extrémité effilée de la pipette pour la mouiller et pouvoir saisir sur la lame, par adhérence, une parcelle à ensemencer que l’on portera ensuite délicatement sur la gélose.
Avec un peu d’habileté, il est possible de toucher seulement la parcelle de poil à prélever sur la lame, de l’entraîner par adhérence et de la déposer sur la gélose, sans laisser d’autre trace que le petit point formé par la parcelle de poil ensemencée,
Renouveler cette opération 4 à 6 fois par tube, en plaçant les points d’ensemencement de 2? cm à £2cm5 d'intervalle.
Il est inutile de flamber chaque fois la pipette et de la plonger à nouveau au fond du tube.
L'ensemencement du tube achevé, flamber l'ouverture et boucher au coton.
En suivant cette technique, je suis parvenu à réaliser des ensemencements très corrects et à obtenir des tubes de gélose inclinés présentant 5 ou 6 points de culture primaire du champignon, absolument pure.
La sûreté de cette méthode m'a permis de limiter mes ensemencements pour chaque souche à 2 tubes de culture : un de gélose maltosée, l’autre de gélose glycosée.
En cas d’impuretés, le champignon doit être repiqué en temps voulu pour obtenir une culture pure.
4° Examen mycologique et coloration du champignon
Cet examen comporte le prélèvement du champignon, sur les divers milieux de culture, à des intervalles déterminés, en vue d'étudier sa morphologie.
En outre, il convient de faire la description des caractères macroscopiques de la culture, au cours de son évolution, s'il s’agit d'une espèce nouvelle.
L'époque des prélèvements varie suivant l'espèce et le milieu de culture :
sur milieux d'épreuve classiques, les champignons à culture duveteuse doivent être examinés à partir du 10° ou 12° jour de la culture ; alors que les champignons à culture faviforme (Trichophylon mégasporés des bovidés) ne peuvent être examinés utilement qu'après 1 à 2 mois de culture :
sur les milieux naturels, l'examen peut être fait à partir du 12° au 15° jour, quel que soit le champignon étudié.
Ces examens sont renouvelés tous les 4 ou 5 jours et aussi
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longtemps que la culture le permet. Certains organes, les vrilles par exemple, se développent tardivement, à partir du 30° jour ; les aleuries et les fuseaux apparaissent dès le début de la culture, vers le 10° ou 12° jour.
Les prélèvements sont effectués avec un fil résistant (fil de ferro-nickel) légèrement incurvé à son extrémité. Ils doivent être pratiqués avec délicatesse et en petite quantité.
Le champignon prélevé est déposé sur une lame, dans une goutte de colorant et soigneusement dilacéré avec deux aiguilles droites, en prenant soin d'éclairer la lame porte-objet par en dessous, à l’aide d’un miroir.
Le colorant utilisé a été le lactophénol-bleu-coton-soudan, suivant la formule donnée par M. Langeron : solution saturée à chaud de soudan III dans le lactophénol, additionnée d’un millième de bleu coton. La membrane, surtout lorsqu'elle contient de la callose, et le contenu protoplasmique sont colorés en bleu ; les globules graisseux sont colorés en rouge brun.
Les préparations sont lutées au lut de du Noyer. Très claires au début, ces préparations s’obscurcissent avec le temps par précipitation de la matière colorante. Celles qui présentent des formes intéressantes à fixer doivent être photographiées dans un délai de 8 à 10 jours. S'il ne peut être fait de microphotographie, les détails intéressants sont dessinés à la chambre claire.
J'ai aussi pratiqué des micro-cultures sur lame gélosée des Trichophylon mégasporés des bovidés. Ces cultures doivent être examinées du 40° au 60° jour. Elles sont fixées et colorées au bleu coton, suivant la technique de Rivalier et Seydel.
5° Détermination de l'espèce du parasite étudié
La détermination des espèces isolées est faite d’après :
les caractères du parasite dans le poil : aspect microsporique, microïde où mégasporé ;
les caractères macroscopiques de la culture et le temps de son
évolution. On sait que les cultures de teignes évoluent lentement et ne sont constituées que du 12° au 15° jour. Les moisissures poussent au contraire très rapidement. La comparaïson de la culture obtenue avec les caractères distinctifs de culture d’espèces connues, sur le même milieu, permet l'identification de l’espèce isolée ;
les caractères morphologiques microscopiques du champignon, après coloration. La recherche et l'identification de ces caractères doit être faite avec beaucoup de soin et de méthode.
Seules, les cultures primaires ou provenant d’un premier repiquage peuvent donner, aux points de vue des caractères macroscopiques de la culture et de la morphologie du champignon, des renseignements précis.
En cas de doute, pour la détermination d’une espèce, J'ai recherché, après micro-cultures sur lames, la fusion des hyphes avec l'espèce connue à laquelle le champignon étudié paraissait se rapporter. Davidson (A.M.), Dowding (F.S.) et Buller (A.H.R.) ont, en effet, montré que les mycéliums de champignons des teignes de même espèce, mis en présence, se fusionnaient par anastomose, alors que cette fusion ne se produisait pas s’il s'agissait d'espèces différentes. Cette fusion a été obtenue entre filaments d’un mycélium issu d’une ou de deux colonies à point de départ monospore et indépendamment des phénomènes sexuels.
6° Inoculations expérimentales - Rétro culture
Pour les espèces qui n’ont pu être rapportées à aucune espèce décrite, le caractère parasitaire du champignon a été confirmé par l’inoculation au cobaye.
Ces inoculations ont été pratiquées par scarifications sur la région dorsale. La culture à inoculer, de préférence assez vieille, est étalée sur la région scarifiée avec un scalpel flambé.
Les lésions cutanées constituées par de la rougeur, la formiation d’une croûte séro-sanguine et une exfoliation épidermique, évoluent en 8 à 30 jours.
Les Trichophyton mégasporés des bovidés donnent toujours des résultats tardifs.
L'existence, dans ces lésions, de poils envahis par un mycélium, sporulé confirme qu'il s’agit d’un champignon des teignes.
Le cycle est complet et la preuve est faite que le champignon étudié est bien l'agent parasitaire de la teigne observée chez le cobaye inoculé, lorsqu’en partant des poils prélevés sur cet animal on obtient une rétro-culture qui présente les mêmes caractères macroscopiques et microscopiques que la culture ayant servi à l’inoculation.
