I IV

Fixation de l'azote dans le sol par action microbienne.

M. Berthelot. — MM. Hellriegel et Wilfarth.

M. Berthelot avait remarqué que les sables jaunes

qui se trouvent au-dessous des meulières et pierres

1. Comptes rendus, t. CI, p. 775. — Cette séance fut particulièrement mémorable; c'est ce jour-là que M. Pasteur lut son mémoire sur la méthode à employer pour prévenir la rage après morsure (26 octobre 1885).

FIXATION DE l' AZOTE DE L*AIR PAR LES MICROBES 143

siliceuses des plateaux de Meudon et de Sèvres, exposés h Tair pendant quelque temps, ne tardent pas à se couvrir de végétation ; il y détermina rigoureusement Tazote combiné, puis les exposa à Faction de Tair dans une chambre à l'abri de toute émanation. 11 procéda à ranalyse à diverses reprises et vit Tazote combiné s'accroître lentement, mais d'une façon continue, le

29 mai 1884, on avait trouvé par kilo 0«%0705; le

30 avril 1885, un kilo renfermait 0»'',0833 : le 10 juillet 0«M035 et le 24 octobre 0«r,1105. Un autre sable jaune, une argile blanche, donnèrent des résultats analogues. Les mêmes expériences furent répétées avec les terres précédentes, en plein air : les pots étaient placés sur des tréteaux, dans une prairie, sous un toit qui les préservait de la pluie verticale ; une autre série d'expériences fut disposée au sommet de la tour de 22 mètres, dont on aperçoit la silhouette au-dessus des arbres de Meudon ; enfin, ces mêmes terres furent placées dans de grands flacons bien fermés.

En étudiant les terres, maintenues ainsi en observation pendant plus d'une année, M. Berthelot reconnut que l'augmentation de l'azote n'était due ni à de Tammoniaque, ni à de l'acide azotique, mais à la formation de matières organiques. Pour connaître leur origine, pour savoir comment elles avaient été produites, M. Berthelot soumit des échantillons de ces divers sols à l'action d'une température de 100 degrés durant plusieurs heures, puis à celle d'un courant de vapeur d'eau prolongé cinq minutes. Pendant le refroidisse-

ment, on ne laissa entrer dans Tappareil que de Tair filtré sur des tampons de coton enduits de glycérine, de façon à retenir tous les germes que l'air pouvait entraîner; les terres furent enfin abandonnées à ellesmêmes, pendant un temps prolongé; on ne put y déceler la moindre fixation d'azote.

Visiblement, quand on porte une terre à 100 degrés, on ne change rien à sa composition, à sa nature physique, mais on tue les micro-organismes (ju'elle renferme, et, puisque les terres normales fixent Fazote, mais qu'elles perdent cette propriété aussitôt qu'elles ont • été portées à 100 degrés, il faut en conclure que ce sont ces micro-organismes qui sont l'agent de cette fixation.

Les terres mises d'abord en expériences étaient très pauvres en carbone et en azote, elles ne représentaient pas des sols cultivables avantageusement, et il était intéressant de chercher si la fixation de l'azote par action microbienne pouvait se produire encore dans des sols déjà enrichis de matières organiques par des végétations antérieures. C'est ce que fit avec succès M. Berthelot, pendant l'année 1886, pour des sols nus ou couverts de végétaux, notamment d'amarante. Estce à dire que toutes les terres soient capables de fixer l'azote atmosphérique, et qu'une terre, dans laquelle cette fixation se produit dans certaines conditions, s'enrichira d'azote si ces conditions sont changées? Non; M. Berthelot s'est efforcé de préciser ces conditions Tannée même où sa découverte était vivement attaquée par M. Schlœsing.

FIXATION DR f/aZOTK DE l'aIR PAR LES MICROBES 145

On sait que réminent directeur de TEcole d'application de Tadministration des tabacs est un des expérimentateurs les plus habiles de ce temps; il a doté la science agricole de méthodes analytiques excellentes, d'instruments qui conduisent à exécuter les recherches avec plus de précision et de facilité qu'on ne le faisait naguère. Or, M. Schlœsing reprit les expériences de M. Berthelot, en opérant par une autre méthode. Au lieu de chercher la quantité d'azote engagée en combinaison dans la terre arable au commencement et à la fin des observations, il met ces terres en expériences dans un volume d'air soigneusement mesuré et cherche si, après que cet air est resté pendant six mois par exemple avec la terre, une fraction plus ou moins forte d'azote quitte l'état aériforme pour s'engager dans une combinaison solide ; or, dans aucune des expériences qu'il a exécutées en 1887, cette disparition d'azote gazeux n'a pu être constatée.

Toutes les incertitudes reparaissaient. La querelle qui avait séparé pendant de longues années MM. Boussingault et George Ville se ranimait entre MM. Berthelot et Schlœsing.

MM. A. Gautier et Drouin exécutaient bien, en 1888, une série d'expériences à l'aide de sols artificiels laissés nus ou couverts de végétaux, et constataient que ces sols s'enrichissaient d'azote, mais ils n'en tiraient pas cette conclusion que cet enrichissement provînt de l'azote libre de l'atmosphère.

Cette réserve se conçoit aisément. Les chimistes sont

habitués à considérer l'azote comme un gaz inerte ; il résiste à l'oxygène, ne s'unissant avec lui qu'en proportions minimes sous l'influence de l'étincelle électrique. On forme encore de petites quantités d'ammoniaque en unissant Thydrogène et l'azote, quand on soumet un mélange de ces gaz non plus aux manifestations bruyantes de l'activité électrique, mais aux décharges silencieuses désignées sous le nom d'effluves et qui ne sont visibles que dans l'obscurité ; mais la résistance que présente habituellement l'azote à pénétrer en combinaison est telle, qu'on était fort étonné de voir ce gaz inerte, indifférent aux forces puissantes que nous mettons en jeu dans le laboratoire, céder à l'activité vitale des microbes du sol. Aussi, quelque illustre que fût le nom de M. Berthelot, quel que soit l'éclat dont rayonne l'œuvre immense qu'il a accomplie, les chimistes, flottant entre les affirmations contradictoires de deux savants de haut mérite, hésitaient à conclure, quand le problème fut abordé en Allemagne par d'autres observateurs, qui démontrèrent la flxation de l'azote atmosphérique, par action microbienne, à l'aide d'expériences décisives.

Les opinions des cultivateurs, leurs modes de travail, reposent presque toujours sur une très longue série d'observations dont on doit tenir compte; or depuis longtemps ils avaient distingué parmi les plantes de grande culture quelques espèces qu'ils appelaient améloriajfites . Us avaient reconnu, par exemple, que lorsqu'on sème du blé ou de l'avoine sur un défriche-

FIXATION DE L'aZOTE DE L'AIR PAU LKs MICROBES 147

ment de trèfle et de luzerne, il n'est pas nécessaire de distribuer d'engrais et que, sans aucun apport, habituellement la récolte est excellente; la terre semble avoir été enrichie, améliorée par la culture du trèfle ou de la luzerne ; en général, par la culture des espèces appartenant à la famille des légumineuses. On avait reconnu en outre, par l'analyse comme par l'emploi de ces fourrages dans Talimentation des animaux, que ces légumineuses sont très riches en azote et que cependant les engrais azotés n'augmentent pas leur rendement.

On avait donc été conduit à supposer que les légumineuses sont capables de fixer l'azote de l'air, et c'est ce que M. Georges Ville affirmait avoir observé à bien des reprises différentes, mais il s'était heurté contre les expériences de M. Boussingault, qui, opérant avec sa rigueur accoutumée, n'avait pu constater la fixation d'azote libre.

Les expériences de Téminent professeur du Conservatoire étaient cependant en opposition avec quelques observations de grande culture exécutées avec beaucoup de soins par divers observateurs. En 1873, MM. Lawes et Gilbert divisent en deux parties un champ bien homogène du domaine de Rothamsted; sur l'une des moitiés on sème de l'orge, sur l'autre moitié du trèfle. La récolte de l'orge, soumise à l'analyse, accuse 41'''^7 d'azote, celle du trèfle lôO'^^^ô ; on prélève des échantillons de terre sur les deux champs. Il semble a priori que le sol qui a porté le trèfle doit être appauvri par

les exigences de la récolte très azotée qu'il a fournie; il n'en est rien. On dose, dans i kilo de la terre qui a porté de Forge, lK^460 d'azote combiné, tandis que i kilo du sol emblavé en trèfle en renferme l^^STS. L'année suivante, les deux parties du champ sont Tune et l'autre ensemencées en orge ; la récolte obtenue sur la parcelle qui avait déjà porté de l'orge en 1873 renferme 43"^»', 8 d'azote, celle qui s'est développée dans la partie du champ qui Tannée précédente avait porté du trèfle est plus abondante, elle contient 77^^', 7 d'azote. Ainsi, bien que le trèfle renferme beaucoup plus d'azote que Torge, il laisse le sol plus riche que la céréale, et cet enrichissement est non seulement démontré par les dosages, mais aussi par la vigueur de la céréale qui succède à la légumineuse.

Au reste, toutes les expériences du laboratoire n'étaient pas négatives comme celles de Boussingault ; M. Georges Ville montrait aux auditeurs de ses cours, des cultures de pois, de haricots vigoureuses, bien qu'elles fussent venues sans engrais azoté. En Amérique, M. Atwater cultive des pois dans du sable calciné, mais soutient leur végétation avec des engrais minéraux et de petites quantités d'azotate de potasse, à la récolte, il trouve plus d'azote que n'en contenaient les graines et l'engrais ajouté, les plantes renfermaient un tiers ou môme une moitié d'azote en plus de, celle que renfermait l'engrais distribué. Même en cultivant du sarrasin, M. Joulie avait constaté également, dès 1886, des gains d'azote sensibles ; toutefois rien de décisif n'avait été

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publie quand M. Hellriegel communiqua au congrès des naturalistes de Berlin, en septembre 1886*, les résultats de ses recherches. Le mémoire définitif dans lequel elles sont exposées ne parut cependant qu'en

Les expériences ont porté sur la végétation de diverses espèces, cultivées dans des vases de verre renfermant 4 kilos de sable stérile additionné d'un mélange de phosphate de potasse, de chlorure de potassium et de sulfate de magnésie, auquel on ajoutait des doses croissantes de nitrate de chaux. Quand ces engrais sont distribués à l'orge, on voit les jeunes plantes, d'abord à peu près semblables pendant les premières semaines delà végétation, tant qu'elles vivent sur les réserves contenues dans la graine, se distinguer un peu plus tard les unes des autres ; celles qui n'ont pas reçu d'engrais azoté présentent alors un état particulier, désigné sous le nom caractéristique de faim d'azote. Lorsque les matériaux de la graine sont épuisés, c'est-à-dire habituellement pendant la formation de la troisième feuille, la plante commence à souffrir, elle continue cependant à végéter à peu près aussi longtemps que les plantes normalement nourries ; elle développe tous ses organes jusqu'aux fruits, mais

i. M. Kayser. chef du laboratoire des fermentations, dirigé par M. Duclauz à l'Institut agronomique, a donné un résumé de cette mémorable communication dans le tome XII des Annales agronomiques. Le mémoire, in extenso, traduit par M. J. Yesque» maUre de conférences à la Faculté des sciences, a paru dans le tome XV du même recueil, sous les noms de MM. Hellriegel et Wilfarth.

SOUS une forme naine ; en rëalité, elle n'élabore pas de matière végétale, puisque chaque nouvel organe s'accroît aux dépens de la feuille la plus âgée, qui se vide et se dessèche.

Il semble donc que l'orge aussi bien que l'avoine ne puise son azote que dans les nitrates ajoutés au sol stérile; il en est tout autrement des légumineuses comme les pois; ces plantes acquièrent souvent un développement normal et parfois exubérant dans un sol entièrement privé d'azote combiné, et contrairement à ce qui arrive pour les graminées, l'augmentation ou la diminution de la proportion des nitrates distribués n'entraîne ni un accroissement, ni un amoindrissement régulier de la récolte.

Jusqu'ici les observations de MM. Hellriegel et Wilfarth ne font que confirmer sous une forme plus précise les anciennes observations de M. Georges Ville, mais nous touchons au point décisif de la belle découverte des agronomes allemands.

On prépare quarante-deux vases contenant 4000 gr. de sable, additionné de carbonate de chaux; on y ajoute une dissokition nutritive renfermant : phosphate de potasse, chlorure de potassium, sulfate de magnésie, on introduit dans chaque vase 2 graines de pois germées. Trente pots sont abandonnés à eux-mêmes, dix autres reçoivent 25 centigrammes de délayure de tefre; dans deux enfin, le sable est, avant l'ensemencement, stérilisé au feu.

La délayure de terre est obtenue en mélangeant une

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bonne terre arable, de préférence une terre ayant porté l'année précédente une culture de légumineuses, avec de Teau, laissant reposer quelques instants, de façon à voir surnager au-dessus de la terre le liquide trouble; c'est ce liquide, cette délayure de terre, qui est versée sur dix vases. L'expérience est commencée le 23 mai. Dans les deux premières semaines de juin, aucune différence entre les plantes, elles vivent toutes sur les réserves de la graine; mais dès le 13 juin, toutes les plantes qui ont reçu la délayure de terre deviennent d'un beau vert. Dans les vases qui n'ont rien reçu, quelques pieds sont excellents, tandis que d'autres jaunissent comme ceux des pots stérilisés. Vers le milieu du mois, ces derniers périssent. Enfin, au moment de la récolte, aucun des vases qui a reçu la délayure de terre ne donne au-dessous de 16 grammes de récolte sèche, le maximum étant de 20 grammes, tandis que les vases sans délayure fournissent les récoltes les plus disparates, une très bonne, deux bonnes, deux passables, le reste médiocre ou même nul.

Les expériences répétées les années suivantes donnent des résultats semblables. Toujours la délayure de terre exalte la végétation du sainfoin, des lupins, des pois, tandis qu'elle n'exerce aucune action sur l'orge, l'avoine, le sarrazin, le colza, etc. Quelle est donc l'action qu'exerce cette délayure de terre? Que renferme-t-elle qui lui donne une si merveilleuse activité? Un être vivant, car si on la porte à Tébullition pendant quelques minutes avant de la verser sur la terre, elle perd toute

vertu et n'agit pas plus sur les légumineuses que sur les autres espèces.

Cet être vivant, enfin, ne manifeste-t-il pas sa présence par quelques signes extérieurs? Si vraiment. Les botanistes, notamment M. Prilleux, inspecteur général de renseignement agricole, avaient observé depuis longtemps que, lorsqu'on déterre avec précaution les légumineuses, on voit les racines irrégulièrement couvertes de petites nodosités, de petits tubercules, de la grosseur d'une tète d'épingle. Écrase-t-on ces nodosités sur une lame de verre, de façon à examiner au microscope leur contenu, on le voit rempli de corpuscules allongés, souvent bifurques, peu mobiles. Ce sont des bactéries.

Ce qui appartient en propre à MM. Hellriegel et Wilfarth, c'est la liaison entre l'emploi de la délayure de terre et l'apparition des nodosités: ces éminents observateurs ont parfaitement établi que si dans un sol ensemencé en pois, ou en lupins, on ajoute de la délayure après l'avoir chauffée, les platites pâtissent et meurent, mais qu'aucune nodosité n'apparaît sur les racines. C'est donc à la présence de ces nodosités, à l'existence, dans ces petites protubérances, des microbes qui les peuplent, qu'il faut faire remonter la prospérité des légumineuses semées dans un sol dépourvu d'azote combiné. C'est à la présence, dans l'eau de lavage de la terre, des germes des bactéries productrices des nodosités, qu'il faut attribuer la fixation de l'azote libre.

FIXATION DE LAZOTE DE LAIK VAR LES MICROBES lo^H

Nous voici donc revenus à l'intervention des microorganismes dans la fixation de Tazote par les végétaux ; cette intervention a été encore démontrée par une expérience très élégante réalisée par M. E.Bréal, à mon laboratoire de physiologie végétale du Muséum d'histoire naturelle. Au lieu de déterminer Tapparition des nodosités sur les racines des légumineuses par l'apport de Teau, enlevant au sol les germes qu'il renferme, M. Bréal choisit sur une racine une nodosité bien remplie, la pique avec une aiguille, puis, aussitôt, introduit cette aiguille dans le tissu d'une jeune racine de pois ou de lupin en germination depuis quelques jours. Il plante alors la graine adhérente à la racine piquée dans un sol stérile et à côté il sème une autre graine semblable dont la racine n*a pas reçu de piqûre. L'expérience est très curieuse : tandis que le lupin piqué s'accroît, fleurit, mûrit ses graines, et que ses racines se couvrent de nodosités peuplées de bactéries, le lupin non piqué végète misérablement et finit par périr. Dans le lupin piqué, l'azote surpasse de beaucoup celui que renfermait la graine dont il provient ; dans l'autre plante, on ne retrouve que l'azote contenu dans la graine.

La plante a été inoculée, et l'introduction, dans les tissus de la racine, des bactéries productrices de nodosités, détermine, en effet, leur apparition et la prospérité de la plante devenue capable d'utiliser l'azote atmosphérique.

Les germes de ces bactéries fixatrices d'azote paraissent très répandus dans le sol, et très habituellement,

quand, avec une bêche, on enlève doucement un pied de trèfle ou de luzerne, puis qu'on lave avec précaution les racines, on y distingue sans peine les nodosités distribuées irrégulièrement. M. Bréal les voit encore mieux en cultivant les pois dans Teau de fontaine, simplement additionnée de petites quantités de chlorure de potassium et de phosphate de chaux, mais dans laquelle il écrase un tubercule recueilli sur la racine d'une luzerne; les pois qui fleurirent malgré les conditions anormales de la végétation portaient sur leurs racines des chapelets de tubercules, renfermant des bactéries analogues à celles qui avaient été ensemencées.

Ces connaissances nouvelles ont eu la sanction de la pratique; une terre tourbeuse de la rive gauche de TEms ne donnait que de très médiocres récoltes de légumineuses. On la saupoudre de quelques mètres cubes d'une terre fertile où ces plantes prospéraient, on sème. Partout où la terre fertile a été ajoutée, les pois sont luxuriants ; partout où elle a fait défaut, ils restent chétifs. La terre fertile avait apporté les germes des bactéries productrices de nodosités.

Les faits acquis sont donc les suivants : les légumineuses prospèrent et s'enrichissent en azote quand elles portent sur leurs racines des nodosités peuplées de bactéries; ce sont ces bactéries qui sont l'intermédiaire nécessaire entre l'azote et la plante. La démonstration était éclatante, on ne pouvait nier plus longtemps que ces micro-organismes jouissent de la puissance singulière de triompher de l'inertie de l'azote, et non seule-

FIXATION DE L AZOTE DE l\IR PAR LES MICROBES 155

ment MM. Hellriegel et Wilfarth expliquaient les propriétés améliorantes des légumineuses, mais en outre ils apportaient aux idées de M. Berthelot un solide appui.

Il faut maintenant pénétrer un peu plus avant et chercher comment les bactéries s'introduisent dans les racines, comment surtout la légumineuse bénéficie de leur présence. Bien que ce sujet soit loin d'être complètement élucidé, on peut croire cependant, que les tubercules des racines sont des productions déterminées par l'action des bactéries, comme les galles, si communes sur les feuilles, naissent des piqûres des insectes; ces nodosités seraient utiles à la fois aux bactéries qui y pullulent et aux plantes sur lesquelles elles apparaissent. Les bactéries, trouvant dans le suc de la racine une nourriture appropriée à leurs besoins, peuvent s'y multiplier durant une infinité de générations et se répandre de nouveau dans le sol pendant la vie de la plante hospitalière, aussi bien qu'après sa mort. Quant à la plante elle-même, la bactérie lui fournit le moyen de se pourvoir d'un aliment extrêmement important, l'azote, qui est rarement dans le sol en quantité suffisante. La légumineuse profite mieux cependant que la bactérie, de cette sorte d'association, de symbiose, suivant l'expression consacrée. La légumineuse tire parti de la présence de la bactérie de la façon suivante. Dans la partie de la nodosité la plus voisine de la racine, apparaissent des cloisons qui retiennent les bactéries prisonnières. Après quelque temps, ces prisonnières

périssent, leurs tissus se dissolvent et sont utilisés par la plante. A la partie la plus jeune de la nodosité apparaissent constamment, au contraire, des cellules nouvelles, renfermant de l'amidon qui se solubilise et fournit aux jeunes bactéries les matériaux carbonés nécessaires à leur développement. La plante se prépare ainsi de nouveaux aliments : quand la bactérie aura utilisé Tazote atmosphérique et formé dans ses propres tissus des matériaux azotés, ceux-ci seront résorbés par la légumineuse, et portés jusque dans ses organes aériens par des séries de vaisseaux fibro-vasculaires. La structure anatomique du tubercule est ainsi admirablement adaptée aux conditions de cette vie commune.

Suffit-il, pour être convaincu que c'est bien l'azote atmosphérique qui intervient dans le développement des pois, des haricots, des lupins semés dans du sable additionné de délayure de terre ou vaccinés avec le liquide des nodosités, de constater que l'azote combiné contenu dans les récoltes surpasse de beaucoup l'azote de la graine? MM. Schlœsing fils et Laurent ne l'ont pas pensé.

Ces très habiles physiologistes ont résolu de mettre hors de doute cette intervention de Tazote atmosphérique, en faisant vivre des plantes dans une atmosphère limitée, mesurée avec une exactitude absolue, pour reconnaître si l'azote de cette atmosphère diminuerait du fait même de la végétation. Si cette diminution avait lieu, on devait retrouver l'azote libre disparu, engagé en combinaison dans le tissu même de la

FIXATION PE l'azote DE L AIR PAR LES MICROBES 157

plante. Les deux déterminations se contrôlaient ainsi Tune par Taiitre.

L'expérience exigeait une rare dextérité. En effet, il ne suffisait pas de mesurer intégralement les gaz an début et à la fin de Texpérience, il fallait en outre alimenter les jeunes plantes d'acide carbonique aérien, en l'introduisant à mesure des besoins, dans les vases de végétation, il fallait encore extraire Texcès d'oxygène produit par la décomposition de cet acide carbonique ; il fallait enfin savoir exactement quelle était la teneur en azote des graines semées, priver absolument le sable dans lequel elles devaient se développer de tout Tazote combiné qu'il pouvait renfermer, de façon à retrouver dans la récolte un poids d'azote combiné égal ou très voisin de celui de Fazote disparu de l'atmosphère. Malgré toutes ces difficultés, l'expérience réussit d'une façon complète ; dans une des cultures l'azote gazeux disparu représentait 29 cent. cub. 1, pesant 8^ 0365, on trouva comme augmentation dans la récolte «*■, 0406 ; dans une autre l'azote gazeux disparu représentait 25 cent. cub. 9, pesant k»", 0325, le gain de la récolte fut de «', 0344.

Enfin, comme dernier contrôle, on fit une troisième expérience dans laquelle les pois furent encore semés, mais sans qu'on ajoutât au sol qui les portait les germes provenant de quelques nodosités écrasées. Cette fois les bactéries fixatrices d'azote faisaient défaut, aucun gain ne se produisit. La fixation d'azote fut nulle, ou exactement elle fut de '?*', 0006; c'est-à-dire

iîlH LES FERMENTS DE LA TERRE

* bien inférieure à la limite des erreurs que Ton peut commettre dans de semblables recherches.

Quand l'Académie eut entendu la lecture de ce remarquable mémoire, elle s'associa complètement aux paroles de M. Berthelot, déclarant que ce travail met lin à la longue discussion dans laquelle on était engagé depuis des années, en établissant d'une façon définitive la fixation de l'azote atmosphérique par action microbienne.

Détermination spécifiqm des fixateurs d'azote.

Les légumineuses fixent l'azote de l'air dans leurs tissus quand leurs racines portent des nodosités à bactéries. Le fait est acquis. Les céréales, au contraire, ne paraissent utiliser que l'azote combiné des nitrates ou des sels ammoniacaux, cela découle de nombreuses expériences concordantes ; mais si nous plaçons ces deux familles aux extrémités d'une longue liste comprenant toutes les autres espèces végétales, ne trouveronsnous pas à quelques-unes d'entre elles des propriétés qui les rapprochent des légumineuses? En d'autres termes, les légumineuses sont-elles les seules plantes susceptibles d'utiliser l'azote atmosphérique, ou bien cette faculté existe-t-elle encore dans d'autres familles ? Les anciennes expériences de M. George Ville semblaient montrer que d'autres plantes que les légumineuses