TECHNIQUES D’ISOLEMENT DES DIVERS PRODUITS PATHOLOGIQUES

. Les bases expérimentales que nous venons d'exposer de la méthode d’isolement à l’acide sulfurique, demandent quelques précisions supplémentaires quant à la conduite à tenir suivant les divers produits pathologiques que l’on désire ensemencer. Il est bien évident qu’en face d’un liquide céphalo-rachidien à peine opalescent et d’un ganglion suspect de bacillose, des techniques diverses dont les bases expérimentales demeurent évidemment les mêmes, doivent être établies.

Nous allons done passer en revue les divers produits pathologiques susceptibles d’ensemencement pour recherche du bacille de Koch, en indiquant pour chacun d’eux les particularités qui interviennent dans les manipulations, et les résultats que l’on peut obtenir.

Expectoration

Au cours des chapitres précédents, nous avons eu l’occasion de voir combien avaient été nombreux les essais d’ensemencements de crachats, ce sont eux également qui ont provoqué les premiers essais de culture.

En plus de la nécessité d'éliminer les germes d’infection secondaire sans altérer la vitalité du bacille de Koch, une difficulté particulière réside dans la nécessité de dissocier les mailles mucopurulentes et les leucocytes dans lesquels il se trouve enrobé pour lui permettre d’abord le contact avec l’acide, puis avec la surface du milieu.

Ne revehons pas sur les méthodes au formol, à l’antiformine, ni même sur la méthode à la soude de Pétroff. La méhode à l’acide sulfurique justifie la faveur dont elle jouit actuellement.

I] y a intérêt à séparer les parties purulentes du crachat d’avec la salive ou les parties d’expectoration plus liquides qui sont très pauvres en bacilles ou n’en contiennent pas du tout. Une véritable dissociation de la masse bacillifère doit alors être réalisée au mortier, en triturant pendant cinq minutes environ jusqu’à obtention d’un aspect uniforme. L'action de l’acide est alors régulièrement obtenue et la liquéfaction du erachat parfaite. Dans le mortier même, on ajoute un égal volume d’acide sulfurique à 15 % pendant une demi-heure à la température du laboratoire, ou mieux, à l’étuve à 37°. On ajoute une ou deux gouttes de tournesol comme réactif indicateur et on neutralise avec une solution de soude à 30 % jusqu’à obtention d’un virage lilas (limite de neutralité à pH — 7,2). On ensemence alors à raison de 0,5 centimètre eube par tube, cinq tubes au moins de milieu à l’œuf de Pétragnani modifié par Saenz. On peut également, grâce à la neutralité du produit, procéder à une Imoculation au cobaye. D'autre part, à la suite de ces diverses manipulations, une véritable homogénéisa-

tion des crachats a été réalisée et un examen direct à ca moment, présente un intérêt tout particulier.

Pus

Les pus d’abcès froids, si souvent infectés secondairement donnent des résultats particulièrement déce: vants, quel que soit le procédé d’homogénéisation et la patience du chercheur lorsqu'on pratique la bacilloscopie.

La culture est, par contre, fort aisée et fructueuse. On opère comme pour les crachats, le pus ainsi traité arrive à un bon résultat de fluidification et peut ainsi être répandu en couche unie et mince à la surface du milieu.

Liquides pleuraux et articulaires

On sait combien rares sont les cas d’épanchements séro-fibrineux où l’examen direct permet de mettre le bacille de Koch en évidence, bien que le diagnostie étiologique ne soit pas douteux. La méthode de culture donne des résultats particulièrement satisfaisants, certaines statistiques apportent jusqu’à 80 % de résultats positifs, mais en moyenne, les résultats oscillent autour de 50 %. Deux cas sont à distinguer selon que l’on se trouve en présence de liquide non secondairement infecté ou contaminé par une flore secondaire.

De toute Page le liquide devra être HUE sur billes de verre ou sur ? ce. de citrate de soude à 10 % pour éviter la formation d’un coagulum. Si cependant ces précautions n’ont pas été prises, le coagulum sera détruit au mortier; ç’est à partir de lui, en effet, qu’il est intéressant de faire un ensemencement, les mailles du système fibrineux du coagulum enserrent les bacilles comme dans un véritable filet; ils se trouvent ainsi rassemblés aussi bien que pourrait le faire une centrifugation prolongée. La formation de ce coagulum n’est cependant

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pas souhaitable à cause des manipulations supplémentaires qu’elle fait entrer en jeu.

Liquides non secondairement infectés. Après les avoir recueillis aseptiquement sur Billes de verre ou citrale de sodium, on ensemence directement sur les milieux à raison de 1/2 centimètre cube par tube.

Liquides secondairement infectés. 15 à 20 ce. d’exsudat pleural sont recueillis sur billes de verre ou citrate de soude, on centrifuge pendant un quart d’heure; le culot, additionné d’un égal volume d’acide sulfurique à 15 % est dissocié au mortier et on laisse en contact un quart d’heure. Après addition de quelques gouttes de tournesol, on neutralise avec une solution de soude à 30 % jusqu’à teinte lilas; l’ensemencement est alors effectué.

Liquide céphalo-rachidien.

Cest à un des cas où le triomphe de la méthode d’ensemencement des produits pathologiques suspects de bacillose, est particulièrement éclatant. Le pourcentage des cultures positives atteint, chez les auteurs qui ont fait appel à la culture, presque toujours 100 %.

Comme il s’agit très exceptionnellement de liquides infectés secondairement et qu'il est facile de les recueillir aseptiquement, l’ensemencement n’a pas besoin d’être précédé de contact avec l'acide, on le fera directement à raison d’un demi centimètre cube par tube; s’il se trouve quelques flocons fibrineux, l’opérateur aura soin de les écraser délicatement à la surface du milieu de culture, sans blesser cé dernier.

Urines Dans le diagnostie de la tuberculose rénale, le diaenostie bactériologique joue un rôle prépondérant. Si, pour un grand nombre de cas, l’examen direct suffit: à ï

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mettre le bacille de Koch en évidence, nombreux sont également les cas, où, devant une pyurie amicrobienne, une cystite suspecte, une tumeur épidydinaire, l'examen direct si prolongé, si attentif soitil, ne suffit pas. La culture doit alors entrer en jeu. Elle apporte, en effet, des résultats d’une sensibilité remarquable et dans un délai de temps assez court, dans bien des cas, cette considération est d’une importance essentielle. (C’est une des utilisations les plus fréquentes en pratique hospita-

lèêre de la méthode de culture.

Voici la technique d’ensemencement : s’il s’agit d’urines claires on en centrifuge environ 300 centimètres cubes, mais si elles sont troubles ou sanguinolentes, 40 à 00 centimètres cubes suffisent. On peut aussi se servir

du sédiment obtenu par simple décantation à 500 centi-

mèêtres cubes d’urine laissés vingt-quatre heure à la température du laboratoire. Le culot ou le sédiment est aspiré avec une pipette graduée et déposé dans vr1 morter stérile, puis broyé jusqu’à homogénéisation compiète. 230 à0. minutes suflisent en. général, traiter ensuite, pendant 20 à 30 minutes, par un égal volume d'acide sulfurique à 1ÿ %, si l'infection secondaire parait intense. Lorsque la flore microbienne est peu abondante, l’action de l’acide sulfurique à 10 % pendant +5 ‘à. 20 Minutes suffit. Après avoir ajouté quelques gouttes de tournesol comme réactif indicateur, 6n neutralise à la soude à 30 ou 20 %, selon la concenitratiôn d’acide utilisée jusqu’à teinte lilas qui correspond à la neutralité.

Le culot ainsi traité est ensemencé à raison d’un demi

centimètre cube par tube de milieu.

Si une inoculation doit être pratiquée simultanément, le culot traité est dir ectement utilisable.

Les culots de centrifugation de pyuries amicr obiennes peuvent être ensemencées directement sans traitement à l’acide sulfurique, à condition de pouvoir s’étaler en couche unie et mince à la surface des milieux: j

Les auteurs qui se sont attachés à l’étude de l’ense mencement des urines ont été unanimes pour en constater les avantages. En particulier Saenz et Kisendratp, sur 57 cas suspects de tuberculose rénale, obtiennent 27 résultats négatifs avec résultat semblable à l’examen direct et après inoculation. 20 cas, qui présentaient des sacilles à l'examen direct ont donné des cultures positives dans des délais de 8 à 15 jours. 10 autres qui ne présentaient pas de bacilles après un examen direct prolongé ont donné des résultats de culture positifs dans des délais de 8 à 30 jours.

Liquide gastrique

La recherche du bacille de Koch dans le liquide gastrique offre un intérêt tout particulier chez les «enfants qui ne savent pas cracher et déglutinent leurs expectorations. Le liquide gastrique sera prélevé le matin au réveil de préférence à la sonde œsophagienne, il sera ensuite centrifugé, puis le culot dissocié soigneusement au mortier, sera traité à l’acide sulfurique à 15 ‘% pendant une demi-heure et neutralisé à la soude à 30 % en présence de tournesol. L’ensemencement se fera à raison d’un demi centimètre cube de produit ainsi traité par tube de milieu. Le prélèvement du liquide gastrique fait et ce dernier centrifugé, le problème se ramène à un ensemencement de erachats. }

Selles

La recherche directe du baciile de Koch dans les selles est très souvent vicié par la présence de bacilles paratuberculeux, qui existent en très grand nombre dans les matières fécales. La culture est done tout particulière-

ment indiquée, cependant la présence des microbes sporulés anaérobies de l'intestin, qui résistent À l’action de l’acide sulfurique à 20 et même 25 % pendant 30 minutes, ce qui risque d’atteindre gravement la vitalité des bacilles tuberculeux, complique le problème. Besan.

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con et Braun, après avoir homogénéisé les selles avec de la soude les traitent par quelques centim. cubes d’une solution antiseptique d’oxyquinoléate de soude à 1/500°, qui empêche le développement de germes secondaires.

Tissus

On à rarement l’occasion de pratiquer des erïisemencements de Hopsie en vue de rechercher le bacille de Koch; par contre, en présence de cobayes inoculés dont les organes ne présentent pas de lésions typiques, la culture, à partir de ces-organes, présentent un intérêt évident. Ceux-ci sont prélevés aseptiquement, broyés à see au mortier avec du sable stérile, on ajoute de l’eau en quantité variable suivant la consistance du produit. On procède alors au traitement à l’acide sulfurique à 15 % pendant une demi-heure, puis on neutralise à la soude à 30 % en présence de tournesol. Le produit ainsi traité est suffisamment liquide pour être ensemencé à raison d’un demi centimètre.cube par tube.

| Sang

Il n’entre pas dans cette étude de donner même un simple aperçu sur le problème de la bacillémie tuberculeuse, la somme de travaux et les discussions passionnées qu'ont provoqués les travaux de Loewenstein représente une masse énorme de publications. Exposons seulement la méthode.

Le sang peut être ensemencé directement ou après avoir été recveilli sur citratde de soude ou laqué par adjonction d’eau distillée, on le centrifuge alors fortement, le liquide surnageant rejeté, le culot est lavé à l’eau distillée et ensemencé sur les milieux de culture.

Les tubes de milieu, une fois ensemencés, et quel que soit le produit pathologique dont on est parti, sont placés à l’étave à 38° en position presque horizontale; on dispose habituellement de supports spéciaux qui les maintiennent avee une inclinaison d'environ 15°, On

aura pris la précaution de garnir l’extrêmité des tubes de chapeaux de caoutchouc pour éviter la dessication trop rapide des milieux dans l’étuve; ils sont, en effet, appelés à y séjourner quelquefois pendant près de deux mois. Il n’est cependant pas utile, comme certains auteurs l’ont recommandé, de renforcer l’étanchéité du système par une mince couche de paraffine. Les capuchons de caoutchouc auront été préalablement stérilisés par ébulition dans une solution de fluorure de sodium. Le nombre de tubes à ensemencer ne sera pas inférieur à 9, non seulement parce que cela permet de multiplier les chances de succès, surtout quand on a affaire à des produits paucibacillaires qui sont les plus intéressants, mais aussi parce que le danger de contamination par des moisissures demeurent toujours possible et d'autant plus dangereux qu’au cours du long séjour à l’étuve, si celles-ce1 se développent, la totalité des milieux est alors envahie.