PROCEDE RAPIDE AU CHROMATE D ARGENT

Ceci étant, nous allons décrire en détails la méthode rapide au chromate d'argent, avec les petites variantes que d'autres auteurs et nous avons introduites dans le procédé primitif de Golgi :

1° On commence par couper avec les ciseaux ou le rasoir des petits morceaux de 4 millimètres de côté au plus, du tissu nerveux à étudier ; on les immerge, 24 ^\ 48 ^' ou 56 ^ dans la solution suivante :

Bichromate de potasse 3 grammes.

Eau distillée 100 centim. cubes.

Acide osmique à i % . • • 30 à 35 centim. cubes.

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La quantité du liquide durcissant doit être proportionnelle au nombre des pièces immergées. Ainsi pour trois morceaux de 4 ^"^ de côté il faudra en employer environ 30 ^^, c'est à dire environ 10" du mélange osmio-bichromatique pour chaque morceau de 4 "'™.

Il est indifférent de garder les pièces pendant leur durcissement, à la lumière ou à l'obscurité. La température joue au contraire un rôle assez important. Celle qui nous a paru la plus favorable varie entre 20° et 25°; néanmoins on peut obtenir aussi de bons résultats à la température de 8° à 9°, mais alors il faut faire séjourner plus longtemps les pièces dans le mélange.

2° Les pièces étant retirées du miélange précédent, on les lave rapidement dans de Teau distillée, et on les plonge dans une quantité abondante d'une solution de nitrate d'argent à 0.50 ou 0.75 pour 100. On les y laisse de 24 heures jusqu'à plusieurs jours. D'ordinaire, nous les enlevons de la solution argentique au bout de 36 heures.

Quand il s'agit de cerveau ou de moelle épinière qui sont très près de leur développement complet^ nous ajoutons au nitrate d'argent une à deux gouttes d'acide formique pour 300 grammes de liquide. L'addition de ce produit chimique nous a semblé donner une plus grande limpidité au fond général de la préparation et rendre l'imprégnation plus étendue. Dans les tissus difficiles à colorer, tels que ceux des organes qui se trouvent à une période de développement très peu avancé, nous n'avons pas remarqué qu'il fût utile d'ajouter de l'acide formique. Aussi ne l'employons-nous presque jamais.

L'influence de la lumière et de la température sur les pièces pendant leur séjour dans le bain d'argent nous a semblé nulle. Nous avons l'habitude de laisser les pièces s'imprégner de nitrate d'argent à la lumière et à la température ordinaire. Pourtant il est bon de les conserver à l'obscurité si on ne doit effectuer les coupes que plusieurs jours après l'immersion dans le liquide argentique ; autrement il se produirait au bout de 3 ou 4 jours des réductions irrégulières dans l'épaisseur de la pièce, ainsi que l'a fait remarquer van Gehuchten.

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3° Pour faire les coupes, qui doivent être assez épaisses, afin de permettre de suivre les éléments dans leur plus grand trajet possible, on monte les pièces soit entre deux morceaux xle moelle de sureau décortiquée, soit dans un morceau de liège après les avoir enrobées superficiellement de celloïdine ou de parafine, et on place le tout dans un microtome à vis, par exemple ceux de Ranvier, Reichert, Schanze, Becker, etc.

Voici comment nous procédons : nous commençons par déshj^drater la surface de la pièce en F immergeant dans l'alcool à 95° (40° Cartier) pendant i à 2 minutes, puis nous l'essuyons avec du papier buvard; enfin nous la plaçons sur un morceau prismatique de parafine dure. Alors, avec la pointe d'un scalpel ou une aiguille chauffée à la flamme, nous faisons fondre vivement la parafine tout autour de la partie inférieure de la pièce, afin d'inclure cette partie et de la fixer solidement au bloc de parafine. — On comprend qu'il faille exécuter très rapidement cette petite manœuvre afin d'éviter le dessèchement de la pièce. — La partie restée visible du morceau de tissu.nerveux est aussitôt trempée dans l'alcool à 95° et le tout est porté sur le microtome. On fait les coupes en mouillant le rasoir d'alcool à 95° (40° Cartier).

4° On recueille les coupes dans de Talcool à 95°; on les passe dans 5 ou 6 bains du même alcool, en faisant en sorte de ne pas dépasser plus d'une heure pour cette déshydratation, car l'alcool finirait par pâlir les plus fines fibrilles.

5° On retire les coupes de l'alcool et on les place dans un bain d'essence de girofles où elles ne doivent pas rester plus d'une demi-heure. Aussi doit-on procéder au montage des coupes dès qu'eUes sont éclaircies et transparentes.

6° On place les coupes sur une lame porte-objets; on enlève l'excès d'essence de girofles qui les imbibe à l'aide de papier buvard que l'on presse modérément sur les coupes; et on verse sur celles-ci quelques gouttes de xylol pour les débarrasser du reste de l'essence.

7° Après avoir fait égoutter le xylol, en mettant simplement les lames porte-objets dans une position verticale, on couvre les coupes d'une solution peu épaisse de gomme d'Ammar

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dans le xylol. On les met en rangées parallèles en les déplaçant avec une aiguille. On laisse sécher, la lame porte-objet étant horizontale, et à Tabri de la poussière. Au bout de I à 2 heures environ, quand cette première couche de résine d\^mmar est presque sèche, on la couvre d'une seconde, puis d'une troisième, etc., ainsi de suite jusqu'à ce que la surface des coupes complètement couvertes de résine d'Ammar soit tout à fait lisse.

On ne doit pas recouvrir les préparations d'une lamelle, car ainsi elles s'altèrent très rapidement. La cause de cette altération semble résider, d'après Sanassa, dans la production de courants de diffusion qui enlèvent le dépôt de chromate d'argent aux éléments qui en sont imprégnés.

Aussi faut-il laisser les préparations à découvert. Cest là un inconvénient qui exige certaines précautions pour les conserver. Le baume d'Ammar une fois sec, les préparations doivent être mises à l'abri de la lumière et de la poussière.

Malgré tout, leur conservation n'est malheureusement pas parfaite., et au bout de deux ou trois ans le fond des coupes prend une teinte très foncée et le chromate d'argent diffuse plus ou moins autour des éléments imprégnés. Néanmoins on ne peut pas considérer la préparation comme perdue; il n'y a que sa beauté et sa netteté qui se trouvent diminuées ; un éclairage plus fort obvie à Tinconvénient du fond devenu trop optique. D'une façon générale, plus une coupe est épaisse, plus elle a de faciUté à s'obscurcir et à s'abimer. Les coupes d'une minceur moyenne sont celles' que nous avons pu conserver presque inaltérées pendant plus de 4 ans.

On a imaginé divers procédés pour conserver indélébiles les préparations de Golgi. Le traitement des coupes par l'acide bromhydrique (Greppin) ou par le chlorure d'or (Obrégia), en réalité conserve suffisamment bien colorés les corps cellulaires et les expansions protoplasmiques ; mais, par contre, les fines fibrilles nerveuses pâlissent plus ou moins et même se décolorent complètement.

En résumé, les conditions pour la bonne conservation des coupes sont les suivantes : coupes pas trop grosses ; lavage

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complet de ces coupes dans l'alcool, pour enlever toute trace de nitrate d'argent ; dessiccation absolue des coupes sous une couche assez mince de baume d'Ammar; montage à découvert et conservation à l'obscurité.

Procédé de la double imprégnation. — i° Les pièces, sorties du bain d'argent et essuyées avec du buvard, sont placées dans un mélange osmio-bichromatique semblable au premier, ou plus riche en bichromate, c'est à dire dans une solution de :

Bichromate de potasse 6 à 7 grammes.

Eau distillée 100 cent, cubes.

Acide osmique à i % 30 à 35 cent, cubes,

où elles restent de i à 2 jours.

Si l'on craint que les pièces n'y durcissent trop et deviennent friables, il n'y a qu'à diminuer la quantité d'acide osmique.

2° On retire les pièces de ce mélange^ on les essuie au buvard et on les met à tremper pendant 24 heures dans une solution de nitrate d'argent à 0.50 ou 0.75 %^ c'est à dire semblable à celle de la première imprégnation.

Si les préparations sont bien venues, les cellules et les fibres nerveuses doivent apparaître colorées d'une façon tout à fait nette et ressortant sur un fond jaune clair. Les cellules et leurs grosses expansions protoplasmiques sont teintes en noir ; les prolongements nerveux en brun ou en brun-rougeâtre et les collatérales les plus fines en rouge-jaunâtre. Les cellules de la névroglie présentent une couleur rouge sombre, mais elles peuvent être aussi complètement noires.

Le dépôt de chromate d'argent se fait non à la surface des cellules, comme l'ont affirmé Sehrwald et Rossbach, mais d'une manière diffuse dans l'épaisseur même du protoplasma.

Le plus précieux avantage de cette méthode de coloration est qu'elle n'imprègne qu'un certain nombre de cellules, séparées généralement par des éléments restés incolores. Cette particularité heureuse donne aux bonnes préparations la netteté et la clarté d'un schéma. La transparence du fond permet en outre d'examiner des coupes de très grande épaisseur et c'est là encore un autre avantage considérable, car on peut ainsi

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suivre dans une seule et même coupe les expansions les plus longues d'une cellule nerveuse.

Quand il s'agit de cellules dont le corps ne possède qu'une petite quantité de protoplasma, le noyau devient visible, sa couleur café ressortant sur un fond noir.

Règles relatives à l'usage de la méthode rapide au chromate d'argent. — Pour compléter les indications techniques que nous venons de donner, il nous faut signaler quelques règles qui peuvent servir de guide à ceux qui désirent employer la méthode de Golgi; grâce à leur observation, on évitera beaucoup d'essais et d'ennuis.

1° La méthode rapide de Golgi ne donne de résultats constants et absolument démonstratifs dans les organes nerveux qu'à la période voisine de celle de l'apparition de la myéline. Si l'âge de l'animal, auquel on a pris des portions de tissus nerveux, précède de beaucoup la phase de méduliisation, ou s'il correspond à un moment où presque toutes les gaines médullaires se sont formées, la coloration des cellules et des fibres est très inconstante.

2° Il ne faut pas croire que tous les organes nerveux s'imprègnent avec une facilité égale par le procédé rapide de Golgi.

Nos nombreuses expériences nous permettent de ranger ainsi les diverses portions du système nerveux suivant leur constance d'imprégnation : corne d'Ammon du lapin de 8 jours; cerveau du même animal ; moelle épinière du poulet du 7"^^ au 14'"'= jour d'incubation. Ces trois parties sont celles qui se colorent avec le plus de constance et d'une façon tout à fait probante.

Aussi, invitons-nous ceux qui veulent se familiariser avec la méthode de Golgi à s'adonner tout d'abord à Tétude des organes que nous venons d'indiquer ; ils peuvent ensuite aborder plus aisément l'étude d'autres parties plus difficiles. Ajoutons encore qu'on est absolument certain d'obtenir des préparations excellentes de ces organes, pourvu que l'on arrive à déterminer ces deux conditions : la quantité du mélange durcissant et le temps du durcissement.

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Le bulbe olfactif du lapin, du chien et d'autres animaux jeunes et le cervelet d'animaux de quelques jours (cobayes de 8 jours, lapin et rat de un mois, etc.) ne viennent qu'au second rang. Dans ces organes, la réaction tout en étant complète n'est pas aussi constante que dans les précédents. Enfin on doit considérer comme organes difficiles, les ganglions sympathiques , la rétine , la muqueuse olfactive , les terminaisons nerveuses et sensitives, les terminaisons du nerf auditif, etc.

3° Pour obtenir de bons résultats, il importe de choisir l'animal le plus convenable. Les dimensions de Torgane à étudier, ses rapports avec les autres et peut-être certaines particularités chimiques inconnues favorisent ou contrarient la réaction,, évitent ou augmentent les dépôts irréguliers. Ainsi, la rétine se colore mieux chez les oiseaux et les grands reptiles que chez les batraciens, les poissons et les mammifères ; le cerveau du lapin de 8 jours s'imprègne beaucoup mieux que celui du rat, du cobaye^ de la souris blanche, du chien, etc., d'âge correspondant à la même époque évolutive. La moelle épinière des embryons d'oiseaux prend mieux et plus constamment le chromate d'argent que celle des embryons de reptiles et de mammifères ; le lobe optique des oiseaux se teint mieux que les tubercules quadrijumeaux des mammifères, etc.

4° Plus l'organe à étudier est embryonnaire, moins il faut le laisser de temps dans le liquide durcissant. Exemple : on obtient déjà une bonne réaction avec 24 heures de durcissement, pour la moelle de poulet du 5"'° au 6""^ jour d'incubation, alors qu'il faut trois jours de mélange osmio-bichromatique pour obtenir une coloration satisfaisante dans des coupes de moelle de poulet du 14™^ au 15"^^ jour d'incubation. Le cervelet de lapin nouveau-né ne demande que 24 heures de durcissement, tandis que celui du lapin âgé de un mois ne fournit de bonnes coupes bien colorées qu'après 2 ou 3 jours de durcissement.

5^ Il faut autant que possible que l'organe ou morceau d'organe destiné au durcissement^ soit enveloppé par une

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petite portion des tissus environnants. Cest le moyen d'éviter les dépôts irréguliers de la surface des pièces. Par exemple, pour la moelle du poulet, on laisse toujours autour d'elle la colonne vertébrale tout'entière si celle-ci est mince (premiers jours de Tincubation) et seulement une partie de cette colonne vertébrale si elle est volumineuse.

Dans le cerveau il faut laisser toujours la pie-mère. Parfois il est bon, ainsi que le conseille Sehrwald, d'enrober la surface de la pièce (avant l'immersion dans la solution d'argent) d'une couche de gélatine.

6° On saura que le durcissement a été insuffisant quand les coupes montreront un fond rouge uniforme avec des cellules et des fibres imprégnées incomplètement. Au contraire on aura poussé le durcissement trop loin quand le fond apparaîtra jaune clair et qu'on ne verra s'en détacher en noir aucun élément ou seulement quelques fibres nerveuses, en petit nombre.

7° On reconnaît que la pièce a été légèrement surdurcîe, à l'absence presque complète de cellules colorées, et à la coloration presque exclusive des fibres nerveuses. On corrige cet accident en recourant à une seconde imprégnation. On appliquera de même la double et même la triple imprégnation aux organes difficiles à colorer, tels que la rétine, les ganglions sympathiques^ les gangfions intestinaux , les terminaisons acoustiques, etc. Car il est très rare qu'on obtienne une coloration quelque peu complète par une seule imprégnation.

8° Les conditions de l'imprégnation qu'il faut déterminer pour obtenir des résultats assurés sont nombreuses, surtout quand il s'agit d'élucider des questions nouvelles. Aussi est-il nécessaire de procéder par essais successifs. On divise l'organe à étudier en plusieurs morceaux, et l'on fait varier pour' chacun d'eux le temps du durcissement, qui est la partie essentielle de la méthode au chromate d'argent. On laissera par exemple un de ces morceaux 24 heures dans le mélange osmio-bichromatique, un second 36 h., un troisième 48 h., un autre trois jours, quatre jours, etc. Enfin on soumettra toutes les pièces surdurcies à Fimprégnation double ou triple. C'est

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de la sorte qu'on arrivera rapidement à déterminer pour un organe donné les meilleures conditions de réussite. Mais, il faut bien le savoir, Vexpêrience et l'habileté de ropérateur rentrent pour beaucoup dans V appréciation de ces conditions ; le débutant ne doit espérer parvenir au succès dans les sujets d'imprégnation dijficile qu après de longs mois et des essais multipliés et persévérants.

Ce qui arrive pour la méthode de Golgi a eu lieu aussi pour la méthode au chlorure d'or. Celle-ci était difficile et presque impossible dans les mains des débutants ; elle était au contraire un instrument docile, dans les mains de Ranvier, Golgi, Lœwit, Retzius, Rollett, etc., qui grâce à elle firent d'importantes découvertes.

9° Deux circonstances doivent influer considérablement sur la manière de faire du travailleur. Ce sont les suivantes :

Le chromate d'argent a pour propriété particuHère de n'imprégner à la fois qu'un petit nombre de fibres et de cellules ; et il arrive souvent que des cellules qui résistaient à Timprégnation malgré plusieurs mois d'essais persévérants, apparaissent à un moment donné colorées d'une façon merveilleuse.- Aussi doit-on bien retenir que dans tout travail exécuté avec la méthode de Golgi, il faut répéter, et répéter les préparations. D'abord, cela permet d'établir d'une manière complète la structure d'un organe à l'aide des révélations partielles de chaque préparation ; ensuite la répétition même d'un détail histologique dans de nombreuses préparations bien venues est le garant le plus absolu de sa réalité. On évite ainsi de considérer comme appartenant réellement à la structure d'un organe, une disposition due au hasard ou à un caprice d'une imprégnation incomplète, disposition que trop souvent des observateurs inexpérimentés prennent pour définitive et constante.

10° On doit toujours comparer toute préparation des centres nerveux faite par la méthode de Golgi à de bonnes préparations des mêmes tissus adultes, colorées par la méthode de Weigert-Pal et même par le carmin et les couleurs d'aniline.