CHAPITRE PREMIER

Plusieurs fois déjà il a été question de la culture artificielle des microbes, il est temps de dire quelques mots sur cette pratique qui nous a fourni la preuve définitive de la nature animée des virus et permis d'obtenir les micro-organismes patho-

(1) Pour plus de détails, voyez les ouvrages spéciaux sur la ieclinique bactériologique.

gènes à Tétat de pureté, de suivre toutes les phases de leur évolution et d'acquérir sur leurs propriétés biologiques des données très importantes.

Toute culture suppose une semence et un milieu nutritif.

ra

La semence est le microbe même, à Tétat de mycélium ou à rétat de spores. Elle est contenue dans les humeurs ou dans les lésions organiques, chez les animaux malades ou morts d'affections virulentes.

i a. Pour la recueillir, il faut donc puiser une

^' petite quantité d'humeur ou une parcelle d'or-

gane virulents. La récolte des liquides se fait à l'aide de pipettes en verre effilées à une extrémité, bouchées à l'autre à l'aide d'un tampon d'ouate et stérilisées par un passage à l'étuve sèche, chauffée à 200-220 degrés. A la sortie de l'étuve, l'intérieur des pipettes ne renferme plus aucun germe vivant.

Lorsqu'on veut s'en servir, on brise la pointe c avec des pinces, on passe plusieurs fois la partie effilée dans la flamme d'une lampe à alcool ou d'un bec Bunsen, pour détruire les germes qui pourraient exister à sa surface, puis on la plonge dans l'humeur à recueillir; on aspire avec la bouche à l'autre extrémité jusqu'à ce que la récolte soit suffisante ; on la retire enfin et l'on ferme l'extrémité à la lampe, si l'on ne doit pas distribuer immédiatement la semence dans les milieux de culture.

Enfermée dans ces pipettes, la semence se conserve pure comme au premier jour, si l'on prend soin d'observer toutes les manœuvres sus-indiquées. Elle y conservera même longtemps son pouvoir végétatif et son activité pathogène, si elle est à l'état de spores ou si elle n'appartient pas à la catégorie des microbes qui redoutent le contact de l'oxygène libre (microbes anaérobies).

Fig. 18. — Pipette pour la récolte des humeurs virulentes. — c, pointe fermée à la lampe; a, tampon d'ouate ; 6, torsion imprimée au corps de la pipette pour empêcher les liquides d'arriver aisément au contact de l'ouate.

Le milieu de culture peut revêtir l'état liquide ou l'état solide.

En France, à l'exemple de M. Pasteur, on emploie beaucoup les milieux liquides; mais on est loin d'être exclusif; à titre

de comparaison, ou lorsqu'il y a un avantage quelconque à employer les milieux solides qui ont été, nous ne dirons pas découverts, mais introduits en bactériologie par M. R. Koch, on le fait volontiers.

Les milieux liquides les plus usuels sont les bouillons de viande.

Présentons, comme un type, le bouillon de viande de bœuf. Il est préparé de la manière suivante :

On prend i kilogramme de chair maigre ; on la réduit en menus morceaux ou en pâte et on la met en macération dans 2 litres d'eau distillée pendant vingt-quatre heures. Ensuite on fait bouillir le tout pendant deux à trois heures. On laisse refroidir et l'on filtre. On rétablit le volume primitif en ajoutant de l'eau. On additionne le bouillon de 10 grammes de sel marin par litre et de 1 à 2 grammes de biphosphate de soude. Ensuite on neutralise avec du carbonate de soude ou une solution de soude étendue.

Le bouillon ainsi préparé est un bouillon léger. Si l'on désire l'obtenir très léger, on double la quantité d'eau. Si, au contraire, on souhaite un bouillon plus nutritif, on ajoute à la viande 40 à 45 grammes de peptone sèche, au moment où l'on porte sur le feu.

A la viande de bœuf, on peut substituer la chair du veau, du poulet, du mouton, du lapin, de certains poissons, etc. On a quelquefois remplacé la chair musculaire par les pieds de veau. Parfois aussi, on a préparé des bouillons avec des substances végétales, par exemple des navets, des carottes.

M. G. Roux, de Lyon, s'est servi avec avantage de l'infusion de touraillon, à 5 pour 400, pour la culture des streptocoques ; mais il a remarqué que ce milieu était impropre à la végétation du vibrion virgule du choléra.

Enfin, pour répondre à certains besoins, on a additionné les bouillons de viande d'une certaine quantité de sucre, de glycérine ou de quelques corps réducteurs.

La préparation que nous venons de décrire se fait nécessairement en présence de l'air ; par conséquent, lorsque le bouillon est prêt, il renferme sûrement un plus ou moins grand nombre de germes de plusieurs espèces microbiennes qui se mélangeraient ultérieurement à la semence que l'on se propose de cultiver. De là l'impérieuse nécessité de stériliser une provision de bouillon dans des vases où elle sera désormais à l'abri des contaminations par l'atmosphère.

Les vases destinés à cet usage sont ordinairement cylin-

Fig. 19. — Conserve de bouillon.

driques et à deux tubulures (fig. 19). On les charge de bouillon filtré jusqu'aux deux tiers ou aux trois quarts de leur hauteur (c). La tubulure centrale (a) est garnie d'un excellent bouchon traversé par un tube en verre (f), légèrement coudé et fermé

par un tampon de coton. La tubulure latérale (b) est fermée aussi par un bouchon où s'engage un tube de verre (d) qui descend jusqu'auprès du fond. Ce tube coudé deux fois extérieurement est prolongé par un tube de caoutchouc {d') muni d'un ajutage en verre étiré (d"). Le tube de caoutchouc et l'ajutage sont plus longs que la partie interne du tube, de sorte que l'ensemble forme un véritable siphon dont on se servira à certains moments.

Le flacon, ainsi préparé, est enfermé dans une marmite de Papin ou une marmite autoclave quelconque, et soumis à la température de 410 à 415 degrés pendant une demi-heure.

Durant cette opération, le bouillon se trouble légèrement; toutefois le précipité se dépose peu à peu au fond du flacon, pendant le refroidissement, de sorte que la plus grande masse du bouillon reste indéfiniment claire et transparente. En vieillissant, il peut perdre quelques-unes de ses qualités nutritives; mais il ne sera pas envahi par des cryptogames ou des parasites microbiens.

A part des cas exceptionnels, la culture ne se fait que dans une quantité assez minime de bouillon, déposée dans de petits matras en verre préalablement stérilisés à l'étuve sèche.

On se sert beaucoup du petit matras Pasteur représenté figure 20. Ce petit ballon est muni d'un col rodé à l'extérieur, sur lequel se renverse un capuchon de verre également rodé et surmonté d'une courte tubulure bouchée avec un tampon d'ouate. Si le capuchon de verre vient à se briser, on peut le remplacer par un capuchon en papier. Celui-ci est fait avec une bande de papier soigneusement enroulée sur la face externe du goulot et tortillée au-dessus de ce dernier (fig. 24). Nous avons à peine besoin d'ajouter que par mesure d'éco-

Fig. 20. — Matras Pasteur.

nomie, on substituera sans inconvénient au matras à goulot rodé un matras ordinaire à goulot non rodé.

Notre expérience nous permet d'affirmer que les matras ordinaires avec une vulgaire fermeture de papier se prêtent à Texécution d'excellentes cultures.

Les petits matras s'emploient toujours en nombre plus ou moins considérable. On commence par les stériliser dans rétuve sèche à une forte température. Puis on les charge d'une certaine quantité de bouillon empruntée à la conserve.

Pour faire cette opération, on brise la pointe p de la branche extérieure du siphon dd'd^' (voy. fig. 49); on souffle dans le tube t, à travers le tampon d'ouate, pendant que l'on écarte les

Fig. 21. —Matras à goulot non rodé fermé par un capuchon en papier.

branches de la pince n, de manière à amorcer le siphon ; alors on n'a plus qu'à engager la pointe p dans le goulot de chaque matras et à desserrer la pince w; le bouillon s'écoule naturellement dans le matras. Lorsqu'on a transvasé la quantité nécessaire, on abandonne les branches de la pince à elles-mêmes ; l'écoulement est suspendu; on retire le matras, on le couvre de son capuchon ; puis on passe à un autre ballon et ainsi de suite. L'opérateur doit avoir à proximité une lampe à alcool allumée, afin de soumettre de temps en temps à la flamme l'extrémité p du siphon, le goulot et le capuchon, quand on ouvre et lorsqu'on ferme les matras.

Les matras étant chargés de bouillon, il est prudent, à titre d'épreuve, de leur faire passer quarante-huit heures dans l'étuve à 36 degrés. S'ils restent limpides, l'opération ci-dessus décrite a été bien faite; on peut procéder aux ensemencements.

On féconde les matras en y déposant une goutte des humeurs virulentes que nous avons appris à recueillir.

Au début de ses travaux, M. Pasteur faisait les cultures dans le tube simple ou double qui porte son nom (voy. fig. 22).

Le bouillon était aspiré par la pointe effilée et tombait dans la branche renflée. La semence était introduite ensuite par le même procédé. Ou bien, le bouillon était fécondé préalablement dans un petit matras et aspiré dans le tube. A moins d'indications spéciales, le tube Pasteur n'est guère plus usité.

Fig. 22. — Tube Pasteur double.

Le bouillon est remplacé quelquefois par du sérum sanguin ou du jus de viande.

M. Koch, qui, il est vrai, employait presque toujours le sérum gélifié, a fait connaître un procédé compliqué pour obtenir du sérum stérilisé. Depuis longtemps, nous suivons dans notre laboratoire une technique qui nous paraît plus expéditive et qui néanmoins permet d'obtenir d'emblée du sérum liquide à Tétat de pureté.

Nous choisissons une conserve de 2 litres surmontée de trois tubulures (fig. 23). Les tubulures latérales sont garnies de tubes semblables à ceux de la conserve de bouillon; seulement, on a soin d'engager le siphon d'une toute petite quantité dans le flacon. La tubulure médiane est surmontée d'un tube en verre coudé, à peine effilé à son extrémité libre. Le flacon étant stérilisé, on découvre une grosse veine ou une grosse artère sur un animal de grande taille (cheval, âne ou veau). On lie le vaisseau, du côté de la périphérie pour une artère, du côté central pour une veine. On flambe ensuite sa paroi; on l'ouvre avec un instrument flambé et l'on introduit à l'intérieur du vaisseau le tube coudé S dont la pointe a été préalablement retranchée. Les parois sont étroitement appliquées contre le tube à l'aide des doigts ou d'une ligature. Le sang pénètre alors dans le flacon, par sa propre pression. Quand il l'a rempli aux trois quarts, et pendant qu'un aide lie le vaisseau, on retire le tube et on le ferme à la lampe d'émailleur. Le flacon est ensuite abandonné au repos, dressé sur son fond, dans un lieu frais.

La coagulation du sang s'accomplit; le caillot se rétracte et baigne de toutes parts dans le sérum.

Le moment est venu de transvaser le sérum soit dans de petits matras, si on veut l'utiliser à l'état liquide, soit dans des tubes à réaction, si l'on désire l'amener à l'état solide. Pour cela, on flambe la partie extérieure du tube siphon (d) et on l'enfonce dans le flacon jusqu'à ce qu'il plonge d'une certaine quantité dans la sérosité; on insuffle ensuite de l'air par le tube

Fig. 23. — Conserve préparée pour la récolte du sérum sanguin à Tétai de pureté.

latéral t et le sérum s'échappe au dehors par la tubulure effilée d". On continue Topération de la môme manière que s'il s'agissait de transvaser du bouillon.

Si l'on veut employer du jus de viande, on le stérilise par la filtration à travers un filtre en porcelaine purifié lui-môme par la cha- T-<'^y> leur. { ^^

La culture sur des milieux nutritifs solides a été propagée par M. R. Koch.

Cette méthode, à plusieurs points de vue, présente de sérieux avantages. Les colonies de microbes végètent indépendamment les unes des autres avec des caractères extérieurs qui permettent de les distinguer; par suite, la culture en milieu solide se prôte à la prompte séparation des espèces mélangées dans une humeur.

On se sert beaucoup, pour obtenir des milieux nourriciers à l'état solide, des gelées à base de gélatine fine connue sous le nom de gélatine de Paris. Le moyen le plus simple pour les préparer consiste à faire dissoudre 8 à 10 pour 100 de gélatine dans du bouillon faible ou dans du bouillon peptoné. A l'aide d'une filtration à chaud, on obtient une gelée extrêmement transparente qui reste prise jusqu'à la température de 25 degrés.

Les provisions sont réparties dans des matras ou plus souvent dans des tubes à réactions.

Suivant que l'on veut posséder une surface de culture plus ou moins étendue, on incline les tubes ou on les maintient verticaux pendant la solidification de la gelée. La figure 24 montre deux tubes garnis de gélatine nourricière et ensemencés, l'un (A) en surface, l'autre (B) en profondeur par piqûre.

Si l'on veut exposer les cultures à une température de 35 à

g. 2-i. — Deux tubes garnis de gélatine nourricière et ensemencés. — 1, 1, colonies de microbes; 2, tampon d'ouate ; 3, capuchon de caoutchouc pour prévenir révaporation et la dessiccation.

40 degrés, il faut substituer à la gélatine qui est beaucoup trop fusible, 20 grammes de gélose pour 1 litre de bouillon. La gélose, appelée encore agar-agar, provient des frondes d'une algue de la mer des Indes; elle sert à préparer des gelées commerciales.

MM. Nocard et Roux augmentent la valeur nutritive de Tagar en y ajoutant 5 pour 100 de glycérine neutre.

Naeggerath ajouta à la gélatine plusieurs substances colorantes solubles, pour faciliter la distinction de certaines espèces microbiennes. En effet, telle espèce se charge pendant la végétation d'une couleur déterminée, telle autre d'une couleur différente.

M. Koch, comme nous le disions plus haut, s'est servi du

sérum solidifié, surtout au début de ses études sur la culture du bacille de la tuberculose. Il obtenait la gélatinisation du sérum sanguin en couchant les tubes chargés de ce liquide sur le fond d'une étuve inclinée (voy.

fig. 25) dont la tempéra- ,,. ^^ ^. .,...,,. , ture est maintenue entre

rig. 25. — Etuve inclmce de Koch pour la «p. . na j x stérilisation et la gélatinisation du sérum "'^ ^^ "^ aegres.

sanguin. L'ensemencement sur

la gélatine ou dans la profondeur de ce milieu se fait à l'aide d'une aiguille de platine montée sur un manche de verre. Celle-ci est chargée d'une parcelle d'une culture précédente ou d'une humeur virulente, puis on la promène sur la surface inclinée de la gélatine ou bien on la plonge verticalement dans la profondeur. Là où les germes se sont arrêtés, on voit se développer des colonies d'abord séparées, mais qui pourront se confondre au fur et à mesure que leur croissance les mettra au contact.

Si l'expérimentateur devait isoler les espèces contenues dans une culture impure ou dans un mélange, il emploierait le procédé de M. Koch qui consiste à déposer avec l'aiguille de platine une parcelle du mélange dans 10 centimètres cubes de gélatine fluidifiée à 30 degrés, à mélanger intimement par agitation et à verser le tout sur une plaque de verre maintenue horizontalement sous une cloche qui la protège contre les germes de l'atmosphère. La gélatine se solidifie sous une couche mince, uniforme, dans laquelle les microbes forment

des colonies que Ton peut distinguer à la loupe, grâce aux caractères extérieurs qu'elles présentent, et recueillir isolément au bout de Taiguille de platine pour les faire pulluler séparément dans des tubes ad hoc (voy. fig. 26).

Plus simplement, il emploierait le procédé d'Esmarch. Celuici consiste à mélanger la parcelle à analyser dans une toute

Fig. 26. — Appareil de Kocli destiné à faire des cultures d'isolement sur des plaques de verre. — t, trépied, muni de vis calantes r, destiné à soutenir la plaque de verre a dans une direction horizontale; n, niveau à bulle d'air; p, plaque sur laquelle la gélatine se solidifie ; c, cloche protectrice.

petite quantité de gélatine liquéfiée au fond d'un tube à essai ordinaire (voy. fig. 27). Quand le mélange est intime, on incline le tube presque horizontalement et on le fait tourner rapidement entre les doigts sous un filet d'eau froide ; la gélatine se solidifie presque régulièrement en couche mince sur la face interne du tube. Les colonies se développent écartées les unes des autres, à l'abri du tampon d'ouate; on peut alors les récolter isolément avec l'aiguille de platine. Le procédé d'Esmarch met plus que celui de Koch à l'abri des germes de l'atmosphère. Arloing.

Très souvent encore, on cultive les microbes sur la pomme

de terre cuite, sur Tempois d'amidon ou de riz, sur du blanc

d'œuf cuit, sur des tranches de pain, sur des fruits, etc. Ces

indications générales étant connues, le lecteur

,--^7 ^^ devinera aisément les procédés que le micro-

biste utilisera en toutes circonstances pour

obtenir des cultures à Tétat de pureté.

Nous avons supposé jusqu'à présent que les microbes cultivés se plaisaient au contact de Tair. Si la culture devait porter sur des espèces anaérobies, il faudrait poursuivre cette opération dans des récipients disposés pour faire le vide ou pour substituer à Tair un gaz tel que l'acide carbonique ou l'hydrogène. H. Buchner annonça, en 1888, qu'il avait réussi à faire pulluler des microbes anaérobies en plaçant les cultures dans un récipient fermé qui contenait, au fond, une certaine quantité de pyrogallate de potasse, corps avide d'oxygène. Ce procédé est évidemment très simple; mais il ne donne pas les garanties du vide ou de la substitution d'un gaz inerte à l'atmosphère des cultures, à l'aide de la pompe à mercure.

MM. S. Kitasato et Th. Weyl (1890) ont cherché à cultiver les anaérobies dans un milieu solide additionné d'un corps réducteur. M. Liborius avait attribué aux propriétés réductrices du sucre en solution alcaline l'influence favorable qu'il exerce sur le développement des anaérobies. MM. Kitasato et Weyl, s'inspirant de cette remarque, ont essayé des substances qui jouissent de cette propriété à un degré plus élevé. Ils se sont adressés au chlorhydrate d'hydroxylamine, à la pyrocatéchine, à l'hydroquinone, à la résorcine, à l'eikonogène, au chlorhydrate de phénylhydrazine,

au quinon, à l'acétaldéhyde de CHaC^u, au benzaldéhyde

de CôHsC^u, au formiate de soude et au sulfindigotate de

soude. De tous ces corps, les deux derniers ont donné les résultats les plus encourageants dans la culture des microbes

Fig. 27. — Tube préparé selon le procédé d'EsmarchpourTisolement des microbes ; il est parsemé de colonies distinctes les unes des autres.

du tétanos, du charbon symptomatique et de la septicémie gangreneuse. Ces auteurs conseillent d'ajouter 50 centigrammes de formiate de soude à 100 centimètres cubes d'agar, et seulement 30 centigrammes de sulfindigotate de soude. Ils espèrent que Ton trouvera des substances dont Faction sera encore plus satisfaisante pour la culture des anaérobies.

M. Beyerinck a signalé récemment un moyen fort élégant de voir si une substance minérale donnée est un aliment pour les micro-organismes. Les spores ne se développent pas dans la gélatine pure. Par conséquent, si l'on dépose sur de la gélatine pure ensemencée une goutte d'une solution favorable à la végétation, celle-ci se diffusera dans une aire plus ou moins grande sur laquelle la germination ne tardera pas à s'établir; si la solution est incapable de servir d'aliment, la gélatine continuera à rester stérile. Cette méthode peut servir pour essayer l'action des corps qu'on soupçonne d'être vénéneux, ou pour voir de quel aliment dépendent certaines fonctions spéciales des microbes, tels que le dégagement de lumière, la formation de pigments ou d'acides.

Pour plus de détails sur la culture des aérobies et des anaérobies et sur la description et l'usage des étuves à température constante dans lesquelles on dépose les cultures lorsqu'on veut les faire marcher rapidement et uniformément ou bien quand on se propose de déterminer les températures qui favorisent ou entravent le développement des microbes et la conservation de leurs propriétés, nous renverrons le lecteur aux traités spéciaux de technique bactériologique.