CHAPITRE III

Amener les virus à des degrés d'activité qui permettent de s'en servir pour donner préventivement des maladies bénignes est déjà un beau résultat; mais les fixer à ces degrés divers d'activité, faire de leur atténuation comme un caractère de race transmissible de génération k génération est un résultat encore plus remarquable dont M. Pasteur a enrichi la médecine et le patrimoine scientifique de la France.

Nous disions quelques pages plus haut qu'il n'existe pas de difl'érences tranchées entre les moyens de créer l'atténuation individuelle, passagère des virus et ceux qui procurent l'atténuation permanente. Cependant les seconds sont généralement moins violents que les premiers ; mais leur action demande à s'exercer lentement, longtemps et, autant que possible, sur les microbes en voie d'évolution.

En thèse générale, l'atténuation transmissible s'obtient en faisant vivre les microbes plus ou moins longtemps en présence de causes dysgénésiques, soit dans un milieu artificiel, soit dans un milieu animé comme l'organisme d'un animal convenablement choisi.

§ ^^ — Atténuation dans un milieu nutritif artificiel.

Le plus souvent, l'expérimentateur fait vivre les microbes dans un excellent milieu nutritif et demande à l'atmosphère ou à la température ambiantes les influences modificatrices ; quelquefois, il s'adresse seulement à la composition chimique du milieu nourricier. On connaît plusieurs types d'atténuation obtenus dans ces conditions.

A. Atténuations demandées à Vinfluence de V atmosphère normale. — Nous avons raconté, dans la partie consacrée à la découverte de l'atténuation, qu'en changeant le mode de cul-

ture des microbes du choléra des poules par le seul fait d'éloigner les époques des ensemencements, M. Pasteur avait obtenu des virulences progressivement décroissantes, puis un virus vaccinal qui ne tuait plus, donnait la maladie bénigne et préservait de la maladie mortelle. M. Pasteur, prenant ensuite chaque variété de virulence comme point de départ de nouvelles cultures successives faites à intervalles rapprochés, a vu que la variété de virulence se conservait avec son intensité propre. Par exemple, un virus ne tuant plus qu'une fois sur dix gardait cette virulence dans ses cultures, si les intervalles des ensemencements n'étaient pas exagérés.

M. Pasteur a donc réalisé l'atténuation du microbe du choléra des poules et la transmission héréditaire de l'atténuation.

Dans ce cas, l'affaiblissement de la virulence s'établit dans une culture abandonnée à elle-même, peu à peu et spontanément. Il est impossible de prévoir le moment où il aura atteint le degré convenable pour être fixé par la génération, surtout si l'on tient compte des anomalies que M. Pasteur a signalées. « Il ne faudrait pas croire, dit-il, que pour toutes ces atténuations les choses se passent avec une fixité et une régularité mathématiques. Telle culture qui attend depuis cinq ou six mois son renouvellement peut montrer une virulence toujours considérable, tandis que d'autres de même origine sont déjà très atténuées après trois à quatre mois d'attente. » Par conséquent, pour saisir le degré d'atténuation cherché, l'expérimentateur doit faire un nombre considérable d'inoculations d'épreuves échelonnées, à partir du deuxième mois qui suit l'origine d'une culture.

Le procédé, on en conviendra, sacrifie trop au tâtonnement. Il n'est ni scientifique ni pratique. Pourtant l'examen attentif de la cause agissante dans l'atténuation du virus du choléra des poules a conduit M. Pasteur à l'atténuation rationnelle du Bacillus anthracis.

Quelques jours après la fécondation d'un matras chargé de bouillon, la végétation du micro-organisme du choléra aviaire se suspend ; les microbes s'entassent au fond du ballon ; les couches supérieures du bouillon s'éclaircissent. A dater de ce moment, les microbes sont autant de lambeaux de protoplasma ne se nourrissant plus, mais qui continuent néanmoins de subir l'influence comburante de l'oxygène de l'air dont le renouvellement se fait à travers le bouchon d'ouate du matras ; ils finissent même par diminuer de volume, comme l'a remarqué M. Duclaux.

M. Pasteur attribue l'atténuation à l'influence de l'oxygène

de Tair. La virulence^ en effet, résiste au vieillissement plus de dix mois s'il a lieu dans des tubes en verre scellés à la lampe d'émailleur.

Dès lors, il supposa que Faction inhérente à Toxygène atmosphérique se montrerait efficace sur les autres virus, à la condition qu'ils n'eussent pas plus de résistance que le microbe du choléra des poules. C'est ce que M. Rodet a constaté sur le staphylocoque pyogène doré.

Disons en passant que M. Pasteur a peut-être trop négligé l'influence des produits dont le bouillon s'enrichit pendant la végétation des microbes. Rien n'a démontré que la modification qu'ils impriment à la composition du bouillon ne retentisse pas sur la virulence des microbes.

Quoi qu'il en soit, l'idée théorique que nous avons exposée a conduit très heureusement son auteur à l'atténuation du virus charbonneux.

Sous la forme d'organes de végétation, les microbes sont très sensibles aux causes de destruction. Au contraire, à l'état de spores ou de corpuscules germes, les agents de la virulence sont très résistants. Le Micrococcus cholerx gallinarum en fournit un exemple. Il se multiplie constamment par scission; jamais il ne donne de spores. M. Pasteur attribua à cette particularité de son existence la facilité avec laquelle il s'atténue au contact de l'atmosphère normale.

Autrement se comporte le bacille charbonneux. Dans les bouillons de culture, à la température de 37 degrés, il produit de nombreux filaments mycéliens, lesquels se garnissent de spores en vingt-quatre ou quarante-huit heures.

De sorte que si l'on voulait affaiblir ce microbe comme on a affaibli celui du choléra des volailles, il faudrait l'empêcher de se soustraire à l'influence atténuatrice de l'atmosphère et pour cela le maintenir pendant longtemps au contact de l'air à l'état de mycélium, c'est-à-dire l'empêcher de former des corpuscules germes.

C'a été le premier objectif de M. Pasteur. A 37 degrés, le Bacillus anthracis donne du mycélium et des spores ; à 44 degrés, les cultures sont stériles ; à la température intermédiaire de 42%5, il végète encore, mais ne fournit que du mycélium, à formes parfois irrégulières ou monstrueuses, constamment dépourvues de spores. Aussi longtemps que les cultures seront maintenues à 42%5, les bacilles conserveront l'état mycélien analogue à l'état normal permanent du microbe du choléra des poules. Mais peu à peu leur virulence s'amoindrit. Vers le douzième jour, elle ne peut plus tuer les cobayes adultes ; vers

le trente et unième jour, elle ne fait périr que les jeunes souris; au bout d'un mois et demi, elle paraît avoir totalement disparu. Inoculés au douzième jour, les bacilles communiquent rimmunité au mouton et même au lapin.

Portés dans de nouvelles cultures, les bacilles se multiplient et conservent les degrés d'atténuation divers auxquels on les a pris. Cependant l'atténuation ne pourrait être maintenue intacte pendant longtemps par la propagation du bacille.

M. Pasteur a demandé la permanence des nouvelles propriétés des bacilles à leurs spores, car il savait que dans les végétaux supérieurs la reproduction par graines transmet mieux les propriétés acquises que tous les autres modes de multiplication. Il n'a pas espéré en vain. Ayant transporté les cultures mycéliennes d'un thermostat à 42%5 dans une étuve chauffée à 37 degrés, M. Pasteur obtint des spores qui fixaient pour longtemps la virulence des bacilles. « Autant de bactéridies de virulence diverse, dit M. Pasteur, autant de germes dont chacun est prêt à reproduire la virulence de la bactéridie dont il émane. »

Pour la pratique des inoculations préventives, MM. Pasteur, Chamberland et Roux ont préconisé deux vaccins à des degrés d'atténuation différents. Le premier vaccin est obtenu en exposant les cultures quinze à vingt jours à la température de 42',5 ; le second vaccin, en limitant ce laps de temps à dix ou douze jours.

L'atténuation du Bacillus anthracis^ par M. Pasteur, présente une grande supériorité sur l'atténuation du virus du choléra des poules : il est déduit scientifiquement de la biologie des bactériens ; il est réglé dans ses détails et applicable presque à coup sûr; il crée des races de bacilles inégalement virulentes, transmissibles avec leurs nouveaux caractères par voie de génération.

On a dit quelquefois que ces races étaient indéfiniment transmissibles avec leurs propriétés acquises; mais cette assertion passe pour exagérée. Dans une longue suite de générations successives, ou bien dans le sommeil prolongé d'une culture atténuée, la virulence ne reste pas égale à elle-même. Aussi est-on obligé de revenir de temps en temps à la première opération pour conserver des virus vaccins de bonne qualité.

B. Atténuation demandée à Vinfluence de la chaleur. — On a déjà vu que M. Chauveau, poursuivant l'idée première de Toussaint, avait atténué rapidement par la chaleur le Bacillus anthracis dans le sang charbonneux et dans les cultures mycéliennes. Par certaines modifications apportées au procédé,

M. Chauveau a obtenu des spores qui fixent et transmettent fort bien l'atténuation qu'elles ont reçue.

Le procédé modifié comprend quatre temps successifs : dans le premier, on cultive une goutte de sang charbonneux,

Fig. 46. — Schéma montrant en coupe la disposition du thermostat et de Taspirateur pour les grandes cultures. — A, thermostat formé paruneétuve d'Arsonval modifiée ; B, régulateur de température (appareil de M. Chauveau) ; C, aspirateur. — 1, 1, intérieur du thermostat renfermant, 2, un flacon à grande culture; 3, 3, cavité de la double paroi du thermostat; 4, 4, cavité de la double paroi du couvercle; 5, tubulure pour l'introduction du thermomètre donnant la température intérieure du thermostat ; 6, petit flacon à chlorure de calcium pour le dessèchement de Tair entraîné hors du grand flacon; 1, tube adducteur relié au tube plongeant de Taspirateur; 8, tube plongeant de Taspirateur; 9, bouchon fermant l'aspirateur après le remplissage; 10, tube communicant latéral de Taspirateur, gradué pour la détermination de la quantité d'eau écoulée; 11, robinet servant d'amorce au tube d'écoulement; 12, réservoir à mercure du régulateur; 13, son tube ascendant; 14, prise de gas; 15, tube adducteur du gaz; 16, sauterelle; 17, tige du support; 18, pièce à coulissage servant à élever et à abaisser le régulateur qui y est fixé.

à Tintérieur d'un matras chargé d'un bouillon léger, à la température de 42%5. Au bout de vingt heures environ, la culture est peuplée de beaux filaments mycéliens asporogènes. Dans le second, on amoindrit la virulence de ces filaments en portant la culture, pendant trois heures, dans une étuve à 47 degrés.

Dans le troisième, on expose la culture à une température eugénésique (35-37 degrés) ou bien on en sème une parcelle dans du bouillon neuf, et Ton attend que révolution bacillaire

aboutisse à la formation de spores, c'est-à-dire cinq à sept jours en moyenne. Ces spores, d'une belle apparence, sont déjà douées d'un commencement d'atténuation; mais elles ont surtout la propriété de s'atténuer davantage sous l'influence du chauffage. Si donc, dans le quatrième temps, on soumet les cultures sporulées à -j- ^^ degrés, pendant une heure à une heure et demie, elles sont modifiées au degré voulu pour ne plus tuer le mouton, sauf de rares exceptions. En outre, la germination de ces spores atténuées fournit du mycélium possédant la même virulence.

M. Chauveau s'est occupé de la ^ préparation du vaccin charbonneux

^ I (||; par la chaleur, en grande masse,

pour le cas où on voudrait la faire servir à de nombreuses inoculations préventives. Le premier et le second temps ne diffèrent pas de ceux que nous venons de décrire. Seulement, lorsque la culture mycélienne a été chauffée à 47 degrés durant trois heures, on s'assure par des inoculations d'essais que le degré d'atténuation répond au but proposé. Dans le troisième temps, au lieu de semer les bacilles atténués dans un petit matras, on les dépose dans un grand flacon contenant 1 600 grammes de bouillon environ. On a soin de favoriser la multiplication et la sporulation des bacilles en faisant barboter de l'air filtré dans la masse de ces grandes cultures, d'après le dispositif représenté sur la figure 46 ci-jointe.

Reste à imprimer à la récolte l'atténuation définitive que

Fig. 47. — Schéma montrant en coupe la disposition de l'appareil destiné au chauffage des cultures dans l'eau (procédé de M. Chauveau).

— A, vue d'ensemble : 1, intérieur de la marmite ; 2, couvercle; 3, réservoir du régulateur (le reste n'a pas été figuré; voy. la flg. 36); 4, thermomètre; 5, 5, appareil de suspension des tubes à virus; 6, appareil de chauffage; B, vue du profil de Tappareil de suspension montrant la conjugaison, deux à deux, des tubes à virus.

nous avons signalée au quatrième temps. Afin de l'imprimer uniformément à tous les bacilles, M. Chauveau répartit les grandes cultures dans, des tubes ad hoc de 10 centimètres cubes de capacité, préalablement stérilisés ; il bouche ceux-ci exactement, et ensuite les plonge pendant une heure dans un bainmarie chauffé à 84 et à 82 degrés (voy. flg. 47). A la température de 84 degrés, il obtient le premier vaccin; à celle de 82 degrés, le second vaccin.

Ces vaccins conservent leur virulence atténuée un peu plus longtemps que ceux préparés par la méthode de M. Pasteur; mais leur activité diminue peu à peu et finit par disparaître au bout de quelques mois ; elle persiste d'autant moins que l'atténuation a été plus considérable.

Le procédé de M. Pasteur et celui de M. Chauveau aboutissent au même résultat. Pourtant, ils utilisent, en apparence, des facteurs différents. M. Pasteur attribue l'atténuation à l'oxygène de l'air, M. Chauveau, à la chaleur. Mais on remarquera que dans l'un et l'autre procédé, chacun des facteurs invoqués n'agit pas isolément et exclusivement. Ainsi, dans le procédé de M. Pasteur, les cultures mycéliennes sont gardées dix à quinze jours à la température dysgénésique de 42^,5 ; dans celui de M. Chauveau, les cultures mycéliennes ou sporulées sont chauffées en présence de l'air. A quel facteur convient-il d'attribuer l'atténuation?

M. Chauveau a creusé cette question avec le concours de M. Wosnessenski. Il s'est convaincu que dans sa méthode d'atténuation par le chauffage rapide, l'influence de l'oxygène est absolument nulle. Plusieurs expériences lui ont même démontré que l'atténuation par la chaleur est plus rapide dans le vide qu'en présence de l'oxygène. Dans la méthode de M. Pasteur, ce gaz ne joue pas non plus le rôle prépondérant qui lui fut attribué. L'oxygène n'intervient, comme force atténuante, que sur les cultures dont l'évolution est arrêtée par Vabaissement de la température.

Toutefois, M. Chauveau reconnaît que l'oxygène joue un rôle indirect très important dans la production de l'affaiblissement transmissible par hérédité. En effet, l'atténuation est d'autant plus sûrement transmissible qu'elle s'opère sur des bacilles en voie d'évolution lente. Par conséquent, pour que la température dysgénésique de 42°,5 exerce pleinement son influence atténuante, il faut que les bacilles évoluent en sa présence ; or l'oxygène est indispensable à cette évolution. Il est donc permis de croire que la méthode de M. Pasteur donnera, au point de vue de la persistance de l'atténuation, un résultat plus satis-

faisant que le chauffage rapide du mycélium à + 47 degrés et des spores à -f 80 degrés.

En réduisant à d'étroites et justes proportions le rôle de Toxygène de Tair dans les phénomènes que nous décrivons, M. Chauveau a rendu un grand service à Texpérimentation appliquée à l'atténuation des virus. Il a concouru à élargir brusquement les vues du chercheur; celui-ci pouvait croire, avant son travail, que l'atténuation n'avait et n'aurait pas d'autres facteurs que l'atmosphère. Il en est résulté plus de variétés dans la technique de l'atténuation et aussi plus de confiance dans l'avenir de la question; car, de prime abord, l'atmosphère ne paraissait pas être un modificateur que l'on tînt bien en main et dont on pût faire varier l'action au gré de l'expérimentateur et selon la résistance des organismes.

Aussi M. Chauveau ne doit-il pas regretter le temps et la peine qu'il a consacrés à démêler la part respective de Toxygène et de la chaleur dans l'atténuation du Bacillus anthracis. Au surplus, il a la satisfaction de voir aujourd'hui son opinion partagée presque entièrement par l'un des représentants les plus distingués de l'école de M. Pasteur. Effectivement, M. Roux, revenant en 1887 sur l'atténuation du virus charbonneux, a écrit ces mots : « C'est à l'action combinée de l'air et de la chaleur sur les filaments du Bacillus anthracis dépourvus de spores que MM. Pasteur, Chamberland et Roux ont attribué l'atténuation du bacille du charbon, cultivé à une température de 4243 degrés. »

La chaleur a été appliquée à l'atténuation de quelques autres virus. Nous avons fait diminuer simultanément la végétabilité et l'activité du streptocoque puerpéral à la température de 43 degrés. MM. Cornil et Chantemesse ont vu qu'au bout de quatrevingt-dix jours de chauffage à 43 degrés, le microbe de la pneumo-entérite des porcs est atténué au point de ne plus tuer le cobaye et de conférer l'immunité auxanimauxde l'espèce porcine.

C. Atténuation demandée à V influence de V oxygène ou de Vair comprimés. — P. Bert, qui avait eu le mérite de démontrer la toxicité de l'oxygène comprimé sur les animaux, songea, un instant, à utiliser cette découverte pour établir la nature des agents virulents. Aucune cellule vivante ne résiste à l'oxygène sous la tension de 20 à 40 atmosphères. Si donc, dit P. Bert, on soumet le sang charbonneux à cette tension et qu'au sortir de l'épreuve, il manifeste encore de la virulence, son activité dépendra de sa partie liquide et non des microbes qu'il tiendrait en suspension. P. Bert, passant de la conception à Texécu-

tion, s'aperçut que la virulence pouvait durer plus de neuf mois dans du sang charbonneux soumis à Toxygène comprimé et dans lequel les bacilles avaient disparu; Téminent physiologiste conclut qu'elle appartenait à la matière amorphe.

Cette affirmation, lancée au moment où la croyance à la nature animée des virus prenait son nouvel essor, fut examinée par M. Pasteur, qui n'eut pas de peine à prouver que le fait expérimental signalé par P. Bert n'ébranlait en rien la doctrine bactérienne et lui apportait, au contraire, un précieux appoint.

Le résultat obtenu par P. Bert tenait à la résistance différente présentée par les organismes virulents suivant qu'ils sont à l'état de mycélium ou à l'état de spores. L'oxygène comprimé détruit le mycélium aussi facilement que les cellules animales, mais respecte beaucoup plus longtemps les spores des bactériens. Or P. Bert avait soumis à l'oxygène comprimé du sang charbonneux dans lequel les bacilles avaient déjà formé des spores.

Les assertions de P. Bert eurent pour conséquence d'appeler l'attention de M. Chauveau sur l'oxygène comprimé. Il se demanda si ce gaz, agent de vie à la tension où il se présente dans l'air, agent de léthalité à la tension de 20 à 25 atmosphères, si ce gaz, dis-je, sous une tension inférieure à celle qui tue le protoplasma, ne serait pas un simple agent d'atténuation, et il soumit cette hypothèse au contrôle de l'expérimentation.

M. Chauveau confia ce premier soin à M. Wosnessensky, en 1884. Le résultat des expériences ne fut pas conforme à l'hypothèse. On vit que l'air comprimé, à la température favorable ou eugénésique de 35 degrés, conserve au bacille toutes ses facultés végétatives jusqu'à 13 atmosphères, mais les suspend presque tout à coup au-dessus de 13 atmosphères. Quant à la virulence des cultures, l'épreuve parut démontrer qu'elle était augmentée par les tensions faibles, éteinte par les tensions fortes.

Pourtant, M. Chauveau ne se laissa pas décourager. Il pensa que l'excessive susceptibilité du cobaye, animal choisi pour l'épreuve sus-indiquée, n'avait pas permis de saisir la légère atténuation que l'oxygène sous tension avait dû imprimer aux bacilles. Il recommença ses expériences et utilisa le mouton pour tâter la virulence des cultures.

Toutes choses étant égales d'ailleurs, il s'assura que l'oxygène, sous une légère pression, augmente la virulence des bacilles pour le cobaye et le mouton, tandis que, sous une pres- Arloing. 21

sion moyenne, il accroît la virulence pour le cobaye et raffaiblit pour le mouton; enfin, qu'à une pression voisine de celle qui arrête la végétation, il permet des cultures dont les bacilles, avec ou sans spores, tuent le cobaye et peuvent être inoculés impunément au mouton.

En d'autres termes, les expériences personnelles de M. Chauveau démontrent nettement l'action atténuante de Tair comprimé. Si cette influence ne ressort pas des épreuves faites sur le cobaye, il faut en accuser Timpéritie de l'expérimentateur qui n'a pas su d'emblée proportionner la compression et sa durée au degré d'atténuation cherché. Effectivement, dans une deuxième série d'expériences, M. Chauveau soumit quatre générations successives à la pression de 8 atmosphères d'air et à la température de 38 degrés ; il consacra une durée de trois semaines à chaque génération. A l'épreuve, il s'aperçut que la dernière culture tuait le cobaye et respectait le mouton. Il la prit comme semence et soumit quatre nouvelles générations successives à une pression de 9 atmosphères d'air. La végétation démontra que les bacilles, à ce degré d'atténuation, deviennent de plus en plus sensibles à l'action dysgénésique et atténuante de l'air comprimé. Ainsi, à la première génération, sur vingt matras fécondés, vingt se troublèrent; à la deuxième génération, sur le même nombre de matras, deux à trois restèrent limpides ; à la troisième génération, cinq à six ne présentèrent pas de végétation ; à la quatrième, la moitié des cultures fut stérile. A l'inoculation, quelques cultures fécondes se montrèrent inoffensives pour le cobaye.

En principe, l'air comprimé atténue donc le Bacillus anthracis au point voulu pour le rendre vaccinal sur toutes les espèces. Reste à savoir si l'atténuation constatée plus haut est transmissible héréditairement.

A la fin des quatre premières générations sous la pression de 8 atmosphères, lorsque le virus est seulement vaccinal pour l'espèce ovine, la virulence ne tarde pas à devenir nocive, si l'on propage les bacilles à l'air libre dans du bouillon nutritif. Mais à la suite des quatre dernières générations à la pression de 9 atmosphères, les cultures propagées à l'air libre restent inoffensives pour le mouton, le bœuf et le cheval. Cependant leur virulence se relève légèrement sans dépasser le degré suffisant à tuer le cobaye.

On est donc parvenu, avec le temps, en faisant agir l'air comprimé sur une longue suite de générations, à donner à l'atténuation une fixité assez grande pour en assurer la transmission héréditaire. Si l'on arrête l'atténuation à des époques di-

ATTENUATION PERMANENTE TRANSMISSIBLE. 323

verses, pendant la deuxième série de cultures, on obtient plusieurs vaccins dont la virulence est parfaitement graduée.

On peut se demander si l'atténuation est Tœuvre de la pression ou de Toxygène sous tension dans Tatmosphère des cultures.

Dans les conditions où M. Chauveau opéra, le facteur principal a été Toxygène sous tension augmentée. Effectivement, il a obtenu les mêmes résultats en substituant Toxygène pur à Tair atmosphérique et en le soumettant à une pression faible, mais proportionnelle, qui, en définitive, élevait la tension du gaz au même degré que dans l'air comprimé à 8 ou 9 atmosphères. Ainsi, sous une atmosphère d'oxygène pur, l'atténuation est la même que sous 5 atmosphères d'air, la même sous 2 atmosphères d'oxygène que sous 10 atmosphères d'air, etc. Autrement dit, l'oxygène entrant pour 4/5* dans la composition de l'air atmosphérique, la pression nécessaire pour obtenir l'atténuation du Bacillus anthracis en présence de l'air est cinq fois plus faible si Ton remplace ce gaz par de l'oxygène pur. S'il fallait une pression de 10 atmosphères dans l'air pour obtenir un résultat donné, il suffira d'une pression de 2 atmosphères dans l'oxygène pur.

Pourtant, il serait nuisible aux intérêts de la science de regarder la pression comme de nul effet dans le phénomène de l'atténuation. En la plaçant au second plan, nous nous tromperons moins. Des expériences bien conduites avec des gaz inertes démontreraient probablement que la pression, dans les milieux de culture, exerce une notable influence sur la végétation des microbes. Un bacille en développement fait des échanges incessants avec les substances nutritives qui le baignent extérieurement. Or les physiciens ont constaté que les fortes pressions modifient les phénomènes osmotiques entre deux liquides séparés par une membrane poreuse. Ces observations sont, il me semble, applicables aux microbes exposés dans un milieu nutritif à une forte tension gazeuse ; mais jusqu'à nouvel ordre notre opinion est une simple hypothèse.

La connaissance du rôle prépondérant de l'oxygène a permis de simplifier l'outillage nécessaire à la pratique de l'atténuation par l'air comprimé et a supprimé les dangers d'explosion auxquels expose une opération qui exigerait une pression de 12 atmosphères environ.

A la suite de plusieurs expériences préparatoires, M. Chauveau a adopté la technique suivante, pour atténuer le Bacillus anthracis et le transformer en virus vaccinal :

1° On sème une goutte de sang charbonneux ou des spores

dans quelques petits matras Pasteur chargés de bouillon nutritif; 2** on enferme ces matras dans un récipient en acier, solide et bien clos ; puis, par des manœuvres appropriées, on substitue de Toxygène pur à Tair atmosphérique du récipient et on accumule ce gaz jusqu'à 2 atmosphères i/2; 3° on dépose le récipient dans une étuve chauffée à 35-36 degrés pendant quinze à trente jours, en ayant soin de maintenir constamment la pression intérieure à 2 atmosphères 1/2; A° à partir du quinzième jour, on emprunte de la semence à quelques cultures et on la propage dans de grands flacons, afin d'obtenir une abondante quantité de virus atténué.

Dans le quatrième temps, M. Chauveau enferme d'abord une mince couche de bouillon dans les grands flacons où il propage les bacilles atténués ; la semence étant sans cesse en contact avec une masse d'air considérable fournit une récolte très abondante au bout de plusieurs semaines. Lorsque la puUulation est aussi avancée que possible, M. Chauveau dilue les cultures avec du bouillon stérilisé et leur donne le volume de 2 litres environ. Cinq gouttes de cette dilution introduites sous la peau du bœuf et deux gouttes sous la peau du mouton procurent à ces animaux une solide immunité contre le charbon.

L'oxygène comprimé assure une atténuation plus uniforme, plus certaine et plus persistante que la chaleur seule ou combinée à l'oxygène sous la tension normale. Par exemple, les virus conservent leurs propriétés acquises au moins pendant deux mois sans modification sensible. Des vaccins expédiés au Chili donnèrent, après ce long voyage et mille péripéties qui en retardèrent l'utilisation, d'excellents résultats sur le mouton. Mais, passé deux mois, certains bacilles peuvent récupérer une virulence dangereuse, comme on l'a vu dans une expérience entreprise sous les auspices de la Société d'agriculture de Melun.

L'un des effets les plus curieux de l'oxygène comprimé est d'affaiblir profondément la toxicité des cultures en respectant la propriété vaccinale. Ainsi, telle culture qui est incapable de tuer le mouton confère néanmoins à cet animal une solide immunité. Quel immense avantage pour le vaccinateur d'autant plus exposé à semer la mort qu'il cherche à réaliser une préservation plus complète !

Cette précieuse transformation a été obtenue plus complètement encore par M. Chauveau (1889) en soumettant de nouveau à l'action de l'oxygène comprimé le Bacillus anthracis déjà très atténué. A un moment donné, le bacille, alors sur le point de perdre le pouvoir végétatif, peut créer l'immunité tout en se montrant absolument incapable de tuer le cobaye le plus

sensible au charbon. Propagé sous cet état, le Bacillus anthraçis fournit le vaccin idéal, celui qui préserve du charbon sans jamais causer d'accidents mortels.

Quelques microbes pathogènes s'atténuent aussitôt qu'ils pullulent dans un milieu nutritif artificiel. Tel est le cas du vibrion cholérique, du bacille de lapéripneumonie contagieuse du bœuf (Arloing), du diplocoque de la pneumonie de Talamon-Fraenkel (Poa et Uffreduzi). Ces microbes conservent généralement leur atténuation immédiate pendant une suite de générations.

D. Atténuations demandées à une modification du milieu nutritif. — Les antiseptiques, associés au bouillon à doses convenables, pourraient-ils agir sur les bacilles du charbon à la manière de la température dysgénésique de 42%5, c'est-à-dire arrêter la végétation à la phase mycélienne et permettre à l'oxygène d'exercer son influence atténuante comme dans le procédé de M. Pasteur? Tel est le problème que MM. Chamberland et Roux se sont posé et ont résolu en 1883.

Ils ont modifié les qualités nutritives du bouillon soit avec l'acide phénique, soit avec le bichromate de potasse.

Ajouté au bouillon dans la proportion de 1/500% l'acide phénique arrête la végétation du Bacillus anthracis ; dans la proportion de 1/1200®, il permet à la végétation d'atteindre son terme naturel; enfin, dans la proportion de 1/800' environ, il laisse pulluler le mycélium, mais s'oppose à la formation des spores. Les bacilles qui croissent et se multiplient en dépit de l'acide phénique perdent graduellement leur virulence : douze jours après le début des cultures, ils ne peuvent plus tuer le mouton, mais sont encore dangereux pour le lapin et le cobaye ; au bout d'un mois, ils respectent tous ces animaux.

Le bichromate de potasse procède de la même façon ; toutefois il se montre efficace à une dose plus faible et au bout d'un temps beaucoup moins long. A la dose de 1/5000* à 1/2000% il supprime la faculté sporogène des bacilles, et diminue leur virulence, en l'espace de trois jours, au point qu'ils ne tuent plus que la moitié des moutons inoculés.

Reportés dans du bouillon normal, les bacilles atténués se propagent avec leur atténuation en présence de l'acide phénique et du bichromate de potasse. Cependant les bacilles rendus asporogèhes et définitivement asporogènes par l'action du bichromate de potasse continuent à s'atténuer dans les cultures en bouillon normal, si bien qu'après une quinzaine de jours, elles se montrent incapables de tuer le mouton et, plus tard, de tuer même le cobaye.

Nous rapprocherons de Tatténuation par la modification du milieu nutritif à l'aide des antiseptiques, celle qui résulte de la végétation dans un bouillon enrichi des produits de la culture de certains microbes. M. Zagari a atténué le Bacillus anthracis en le cultivant dans un bouillon ayant servi au vibrion du choléra. M. Pavone a obtenu une atténuation transmissible du même agent en le faisant végéter dans du bouillon ayant nourri déjà le bacille typhique.

Du même ordre ou d'un ordre analogue, est le fait annoncé par Metschnikoflf, de l'atténuation du Bacillus anthracis cultivé in vitro dans le sang des animaux rendus artificiellement réfractaires au charbon, pourvu que leur immunité soit aussi complète que possible.

On peut encore obtenir une atténuation transmissible en faisant agir des antiseptiques sur des cultures au repos. MM. Chamberland et Roux ont modifié le Bacillus anthracis en le maintenant au contact de Tacide phénique en solution aqueuse à 1/900®. Au bout d'un mois de séjour dans la solution phéniquée, les bacilles sont encore virulents pour le cobaye et le lapin; si le séjour se prolonge pendant trois mois, ils sont incapables de tuer ces animaux. Par conséquent, l'acide phénique atténue le Bacillus anthracis en dehors des milieux nutritifs ; mais l'atténuation précède de fort peu la destruction du virus.

Ces auteurs ont entrepris de modifier les spores du Bacillus anthracis^ afin d'obtenir ultérieurement des cultures mycéliennes atténuées. Ils ont eu recours cette fois à un modificateur puissant, l'acide sulfurique à 2 pour 100. De deux en deux jours, des spores étaient transportées dans des matras chargés de bouillon normal.

Les cultures issues de ces spores accusaient un affaiblissement de la virulence. Celles dont la semence avait subi l'action de l'eau acidulée pendant huit jours tuaient les cobayes et ne tuaient plus les lapins. Celles qui dérivaient de spores immergées dans la solution acide pendant quatorze jours laissaient vivre une partie des cobayes inoculés.

L'atténuation des bacilles ou de leurs germes à l'état de repos ou d'inertie par les antiseptiques est donc transmissible par génération. Mais MM. Chamberland et Roux ont fait, à cette occasion, une remarque très intéressante. Sous l'influence de l'acide sulfurique, les spores modifiées éprouvent une sorte d'adaptation de la virulence à une espèce donnée. Ainsi, telle culture-fille, qui respecte tous les lapins, tue encore les moutons dans la proportion de sept sur dix.

Ce curieux phénomène établit une transition entre Tatténuation dans les milieux artificiels et Tatténuation dans les milieux vivants qui seuls paraissaient aptes à façonner la virulence pour une espèce animale déterminée.

§ II. — Atténuation dans un milieu nutritif naturel.

L'affaiblissement des virus à la suite de passages réitérés à travers des organismes qu'ils ne hantent pas d'ordinaire avait été signalé à différentes époques.

Nous avons déjà parlé de l'opinion assez répandue qui rattache le virus vaccin au virus de la variole et attribue la bénignité de la vaccine au passage de la variole sur le cheval et le bœuf. A cette occasion, nous avons dit que la Commission lyonnaise n'avait pas vu se manifester la transformation de la variole en vaccine; toutefois M. Chauveau a constaté que la variole, en passant à travers l'organisme du cheval ou du bœuf, devenait plus bénigne pour l'homme.

Magendie aurait obtenu l'atténuation du virus rabique puisé sur Tenfant en le faisant passer successivement plusieurs fois sur le chien. M. Rey, professeur à l'École vétérinaire de Lyon, observa, en 1842, que la bave du mouton rendu enragé par l'inoculation de la salive du chien est plus virulente pour le mouton et moins active pour le chien. M. Galtier a remarqué que le virus rabique pris sur le mouton était moins dangereux pour le lapin.

En 1878, M. Burdon-Sanderson et M. Greenfield s'aperçurent que le virus emprunté à des rongeurs tués avec des bacilles charbonneux recueillis sur le cadavre de grands ruminants est rarement mortel lorsqu'on le reporte sur le bœuf, et pensèrent avoir observé l'atténuation du Bacillus anthracis par l'organisme des rongeurs. On sait aujourd'hui qu'il est préférable d'attribuer le résultat dont ils furent témoins à la grande résistance des animaux de l'espèce bovine au virus charbonneux. Néanmoins, l'idée d'atténuation en était surgie et s'était propagée parmi les microbistes.

On supposait alors que l'affaiblissement de certains virus dans un organisme vivant tenait exclusivement à sa végétation dans un milieu nutritif dont la composition chimique ou la température, par exemple, étaient dysgénésiques, c'est-à-dire défavorables à leur évolution.

M. Pasteur a montré que le problème n'était pas toujours

aussi simple. Voici les faits surprenants et encore inexpliqués que le grand maître de la bactériologie a saisis avec une perspicacité remarquable : en cherchant le microbe de la rage dans la salive d'un enfant mort de la terrible maladie, M. Pasteur recueillit un agent septique qui emportait le lapin avec une rapidité effrayante, tandis qu'il paraissait inoffensif pour le cobaye. L'invulnérabilité du cobaye pour ce microbe n'était pas absolue. M. Pasteur put tuer de jeunes cobayes, âgés de quelques heures ou de quelques jours seulement, avec du sang de lapins morts septicémiques ou avec des cultures du microcoque contenu dans cette humeur. Entretenu pendant plusieurs générations sur de jeunes cobayes, le virus prit une activité de plus en plus grande et parvint à tuer des cobayes plus âgés.

Mais, chose cuîHeuse, arrivé au degré de virulence qui le rendait nocif pour les cobayes adultes, le microbe en question ne tuait plus les lapins; il se bornait à leur donner une maladie spontanément curable, qui leur permettait ensuite de résister à l'inoculation du virus puisé directement sur le lapin ou sur l'enfant.

Du même coup, il était donc démontré : que la virulence n'est pas une propriété fixe et invariable ; qu'elle s'adapte avec le temps au degré de réceptivité de telle ou telle espèce animale ; que cette adaptation n'implique pas toujours, malgré les apparences, une augmentation ou une diminution de la virulence ; enfin qu'un virus amené à son maximum d'activité sur une espèce peut être employé à titre de vaccin sur une autre espèce, au moins pendant un certain temps.

M. Pasteur entrevit immédiatement dans ce résultat, bien qu'il fût plein de complications et d'inconnues, « le secret d'une méthode nouvelle d'atténuation pouvant être appliquée à certains virus les plus virulents ».

L'occasion de démontrer la justesse de cette prévision ne se fit pas attendre.

En 1882, M. Pasteur fut appelé dans le département de Vaucluse pour lutter contre le rouget qui dévastait les porcheries. Il s'y rendit avec le regretté Thuilier et étudia la maladie sous la conduite d'un vétérinaire fort zélé de Bollène, M. Maucuer.

M. Pasteur isola et cultiva le microbe du rouget, et pratiqua des inoculations préventives avec des cultures atténuées par le vieillissement au contact de l'air. Pendant qu'il poursuivait ces premiers essais, il apprit que l'on avait renoncé dans le pays à élever des lapins et des pigeons, ces animaux étant voués prématurément à une mort presque certaine.

M. Pasteur soupçonna que la maladie qui emportait lapins et

pigeons était la même que celle des porcs. Il entreprit des inoculations qui vérifièrent entièrement son hypothèse. Il vit, en outre, que le microbe du rouget, tel qu'il sévit sur le porc, ne possède pas le maximum de virulence qu'il peut revêtir vis-àvis du pigeon et du lapin. En effet, inoculé au pigeon, le sang du porc détermine chez lui les symptômes du choléra aviaire et le fait périr en six à huit jours; le sang du premier pigeon tue un second pigeon en un laps de temps plus court, et ainsi de suite, jusqu'à un certain pigeon sur lequel la virulence paraît avoir acquis une activité maxima et dorénavant constante pour cette espèce. De même, le virus puisé sur le porc fait périr le lapin en quelques jours ; puisé sur le lapin et transmis de lapin à lapin, il tue cet animal de plus en plus rapidement. Il est digne de remarque que le microbe contenu dans le sang des lapins après un certain nombre de passages se cultive plus facilement et devient plus gros dans le bouillon stérilisé.

Lorsque la virulence du microbe eut été exaltée et adaptée à la résistance du pigeon et du lapin, M. Pasteur le reporta sur le porc. Le virus adapté à l'organisme du pigeon lui parut exalté pour l'organisme du porc ; au contraire, le virus qui s'était accoutumé à l'économie du lapin donnait au porc une maladie bénigne d'où celui-ci sortait vacciné contre le rouget.

Par conséquent, en faisant passer le virus du rouget sur le lapin, on le modifie peu à peu, dans le sens positif relativement au lapin, dans le sens négatif relativement au porc; à un moment donné, on peut le faire multiplier dans les cultures et servir utilement à conférer l'immunité aux animaux de l'espèce porcine.

L'influence exercée par l'organisme du pigeon et du lapin sur le virus du rouget a été constatée depuis par plusieurs expérimentateurs, entre autres par M. Cornevin. Mais tout le monde a été unanime à signaler la fragilité des propriétés de ce virus. A Lyon, M. Ghauveau l'a particulièrement constatée. Aussi ne faut-il pas être surpris de la variabilité des résultats fournis par les inoculations préventives contre le rouget. Le vaccin préparé- selon la méthode de M. Pasteur a donné ici des résultats satisfaisants, là, au contraire, une mortalité décourageante. M. Pasteur a expliqué ces différences par la susceptibilité fort variable des diverses races porcines au rouget. De là, la nécessité de préparer autant de vaccins atténués que de races ou de variétés de porcs. D'autres estiment qu'il faut accuser le virus, il est difficile de le maintenir à un degré d'atténuation déterminé. On a noté toutefois, d'une façon générale, que les jeunes porcs de moins de quatre mois sont beaucoup plus

résistants que les adultes aux effets meurtriers du rouget. Aussi, n'importe où. est-il prudent de vacciner seulement les jeunes animaux.

Depuis les travaux de M. Pasteur sur ce sujet fort intéressant, M. 0. Thomas a atténué le virus du charbon symptoraatique et M. Lubarsch, le Bacillus anthracis^ en les faisant vivre dans les sacs lymphatiques de la grenouille. M. Zagari a remarqué que le virus charbonneux, tout en mettant à mal des cobayes infectés avec le microbe de Térysipèle, a perdu une partie de son activité en sortant du cadavre de ces animaux.

Ajoutons que M. Pourquié a vu le virus claveleux s'atténuer et devenir vaccinal en passant sur des moutons doués d'une certaine immunité.

De tous ces faits, nous conclurons que l'organisme animal est un profond modificateur à l'égard de certains virus. Mais il est impossible de prévoir à l'avance où l'on rencontrera cette faculté et dans quelles limites elle s'exercera. Dans l'état actuel de la science, on n'a pas d'autre guide que l'empirisme.