NOUVEAU DÉVELOPPEMENT DE LA MÉTHODE DE MICROSUBLIMATION

2° Recherche de l’arbutoside dans les plantes.

La méthode de microsublimation est employée depuis longtemps dans l’étude microchimique des plantes. Borodine fut l’un des premiers expérimentateurs qui l’aient utilisée [51].

Ce savant a décelé par sublimation la présence de la leucine dans Paspalum elegans et Dahlia variabilis.

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Un autre procédé, celui de la recherche de la théine dans les feuilles de thé indiqué par Behrens [2], semble très compliqué (les feuilles de thé sont mélangées avec de la chaux et de l’eau, la masse est desséchée, reprise avec de l’alcool, puis l’extrait alcoolique est sublimé) ; cette complexité n’était pas faite pour faciliter l’adoption de ce procédé dans la pratique. La méthode attira seulement l’attention générale quand Nestler [28] obtint par sublimation directe la théine, la coumarine et la vanilline. Plus tard, le même procédé fut employé dans l’étude de quelques dérivés de l’anthraquinone [27] pour la gentiane et l’Assa fœtida (401, pour les lichens [35] et pour l’écorce de bouleau [41].

Dans ces travaux, les expérimentateurs cherchaient à obtenir des sublimés cristallins.

Pour ces différents auteurs, la méthode consistait à obtenir le corps lui-même — provenant de fragments de plantes — dans le sublimé, et à l’utiliser pour la diagnose.

Il s'agissait donc d’étudier s’il était possible d’utiliser pour leur identification les produits de décomposition des corps. La condition essentielle est d’obtenir des décompositions faciles et des produits sublimables, l'intérêt de la microchimie résidant en grande partie dans la simplicité de ses méthodes. Nous avons mis au point, pour la Gesse noire, un procédé consistant à utiliser dans la diagnose de l’arbutoside son produit de décomposition sublimable : l’hydroquinol. Voici notre expérimentation :

Microsublimation in vitro.

Si l’on soumet l’arbutoside pur à la microsublimation (hauteur de flamme 5 à 10 millimètres; distance de la plaque d’amiante à la base de la flamme 40 millimètres), le corps commence à fondre au bout de 10 minutes environ. Dans le dépôt sublimé se trouvent des gouttelettes qui, par refroidissement, ne présentent aucune cristallisation. Ces gouttelettes ne donnent pas de réactions caractéristiques. L’arbutoside n’est donc pas décelable dans le sublimat.

Si l’on élève la température et qu’on sublime avec une flamme de 20 millimètres de hauteur, la masse fondue, claire comme de l’eau, se transforme peu à peu en produits rouge-brun, et on trouve dans le sublimé, à côté de nombreuses gouttes de couleur brune, des substances en petits grains et parfois aussi des cristaux. Signalons en passant que les. cristaux s’identifient par leurs réactions à l’hydroquinol. Les produits bruns — dérivés du goudron — qui se forment en même temps, mettent obstacle à la production d’autres réactions. Ces produits bruns ne se laissent pas éliminer par une resublimation qui, de plus, entraîne de fortes pertes.

3 Application au « Lathyrus niger ».

Microsublimation in vivo.

Si l’on soumet des feuilles de Lathyrus niger Bernh. d’une manière analogue, à la sublimation à haute tem-

pérature, il se produit également, çà et là dans le sublimé, des dépôts en petits grains, mais l’apparition

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de dérivés du goudron est encore plus marquée dans le traitement des plantes que lorsqu’on opère sur l’arbutoside pur. La sublimation directe ne conduit donc pas à un résultat utilisable pour le diagnostic, l’arbutoside ne se sublimant pas. Les substances en petits grains sublimées à haute température représentent l’hydroquinol; elles sont difficiles à identifier par suite des impuretés; aussi avons-nous essayé d’hydrolyser l’hétéroside pour obtenir des sublimés caractéristiques.

Si l’on met sur quelques cristaux d’arbutoside deux ou trois gouttes de solution d’émulsine, que l’on mélange les substances sur le porte-objet avec une baguette de verre et que l’on sublime d’abord 5 minutes à basse température (vers 50°, hauteur de flamme de 3 à 5 millimètres, écartement de la plaque d'amiante: de la flamme 6 centimètres) on obtient, en élevant davantage la température, un sublimé cristallin d’hydroquinol d’un blanc pur. L’hydrolyse peut se faire avec le même succès soit avec de l’acide sulfurique étendu au vingtième, soit avec de l’acide chlorhydrique étendu au dixième.

D’autres expériences ont montré que l’emploi de l’acide sulfurique est à rejeter, car à haute température il carbonise la matière, et les bulles qui se forment atteignent le récipient et altèrent le sublimé. La solution d’émulsine et l’acide chlorhydrique étendu au dixième conviennent mieux pour l’hydrolyse.

En utilisant l'acide chlorhydrique, on n’a pas observé la formation de chlorure d’ammonium et le réactif est plus commun que la solution d’émulsine d’une activité inégale. Il faut veiller, d’autre part, dans

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le dédoublement par l’émulsine, à n’opérer qu’à basse température au début de la sublimation. Les sublimés que l’on obtient au cours de la décomposition par l'émulsine montrent les mêmes formes cristallines et les mêmes réactions que dans l’hydrolyse acide. Nous avons done employé, surtout comme agent hydrolysant, l'acide chlorhydrique étendu au dixième.

D'après ce que nous venons de dire, la mise en évidence de l’arbutoside dans les organes de plantes s’obtient simplement par voie de sublimation directe; voie le mode opératoire :

La plante à examiner est autant que possible pulvérisée, La poudre est disposée sur le porte-objet avec 2 ou 3 gouttes d'acide chlorhydrique étendu (1 p. 10), le tout mélangé au moyen d’une baguette de verre et laisse quelques minutes en repos.

On porte alors le mélange sur une plaque d’amiante en mettant un deuxième porte-objet à 3 millimètres d'écartement pour recueillir le sublimat et on chauffe.

En opérant avec une lampe à alcool dont la flamme atteint 10 millimètres de hauteur et avec 50 millimètres d'écartement entre l’objet et la base de la flamme, on obtient en 5 minutes, pour 0,03 à 0.05 gr. de substance, 3 à 4 sublimés cristallins.

4° Caractérisation du sublimat.

a) Caractérisation des cristaux du sublimat.

Nous avons caractérisé le microsublimat obtenu en étudiant d’abord la forme des cristaux, et ensuite ses réactions.

Fic. 8.

Types de cristaux d’hydroquinol obtenus par sublimation directe de la poudre de tige feuillée de « Lathyrus niger Bernh. », humectée avec de l’acide chlorhydrique dilué au dixième.

Les cristaux obtenus directement après hydrolyse par sublimation des fragments de plantes sont très variables. Ils sont identiques aux cristaux préparés en partant d’hydroquinol pur, par la même opération de sublimation.

L’hydroquinol, contrairement à l’arbutoside, se sublime sans entrer en fusion. On sait que c’est un corps dimorphe. Provenant de solutions, il cristallise en prismes hexagonaux ; par sublimation, on l’obtient en petites lames brillantes monocliniques.

Dans notre sublimat, nous trouvons des prismes courts, qui souvent se réunissent en longs cristaux recourbés, et des prismes minces prenant parfois une disposition semi-cireulaire. Sur de gros prismes se déposent des lamelles monocliniques brillantes, dont un grand nombre se rencontrent aussi isolément dans le sublimé. Plus rarement, on observe des squelettes de cristaux en forme d’X. Souvent, il se forme des conglomérats de petits cristaux ressemblant à des feuilles, desquelles sortent par endroits de longs prismes donnant à l’ensemble l’aspect d’un sapin. Ces prismes sont çà et là disposés parallèlement, en palissade. De petits cristaux en forme de feuilles s’assemblent en bouquets et en arborescences.

Les expériences comparatives faites avec l’hydroquinol pur ont montré que les différentes formes cristallines sont surtout conditionnées par l’élévation de la température. Quand celle-ci est trop élevée, il apparaît dans le sublimé des gouttelettes, dans lesquelles l’hydroquinol se sépare en formes arborisées qui paraissent presque noires. Les cristaux se trouvent en

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général au bord du champ de sublimation; parfois ils se séparent des gouttelettes de sublimation. En soufflant fortement sur la préparation, les cristaux disparaissent momentanément et peuvent se regrouper ensuite sous d’autres formes.

La dimension de ces cristaux varie énormément. Les prismes peuvent atteindre 150 # de longueur (généralement 30 à 60 & ), les lamelles ou petites feuilles ont une longueur de 50 # à 20 # en moyenne (fig. 8, p. 63).

b) Identification du microsublimat par voie chimique.

Les cristaux sublimés sont facilement solubles dans l’eau, l’alcool, l’éther, l’aniline, l’acétone, l’amiuoniaque et le sesquichlorure de fer, insolubles dans îe benzène. De la solution dans l’aniline se séparent, au bout de quelques heures, des prismes mesurant jusqu’à 50 & de longueur. En opérant sur la solution acétonique, il se forme des prismes beaucoup plus courts, en partie faiblement arqués, qui se réunissent en petits groupes. Le sesquichlorure de fer étendu dissout ces cristaux, qui deviennent momentanément noirs. La solution prend une couleur verdâtre, mais celle-ci n’est pas très apparente; on la distingue plus facilement en tenant le porte-objet au-dessus d’un fond blanc, ou mieux encore en examinant au microscope le bord de la goutte de liquide.

La réaction à l’ammoniaque est caractéristique au point de vue microchimique. Il suffit de déposer sur les cristaux une petite goutte d’ammoniaque; il apparaît parfois immédiatement ou après une minute de

contact une coloration brune, bien visible au microscope. Pour des traces très faibles, le bord de la goutte de solution, observé au microscope, montre une coloration rouge-brun. Si on laisse la goute s’évaporer (il ne faut pas agiter la solution ammoniacale), il se sépare de la solution rouge-brun des cristaux tout à fait caractéristiques. Les petits sont surtout des prismes incolores; les gros sont jaunâtres, et presque rougebrun au bord de la goutte d’évaporation. Ces derniers se décolorent au bout de peu de temps et ressortent très nettement sur le fond coloré en rouge-brun. En dernier lieu se forment de longs prismes incolores, ainsi que çà et là des cristaux en forme d’X.

On peut traiter également le microsublimé obtenu sur la lamelle elle-même par une goutte de solution aqueuse de quinone; on laisse la préparation se dessécher. On observe alors au microscope la transformation des cristaux en tablettes ou plaques brun-vert de quinhydrone.

Avec les cristaux sublimés humectés par une goutte du réactif à la paranitrosodiméthylaniline (signalé par M. Grossglauser [48]) -on remarque après dessiccation la formation de rosettes cristallines jaunâtres aux extrémités élargies souvent semblables à des feuilles.

Le microsublimat, traité par une goutte de réactif sulfurique formolé à deux pour :cent, donne par agitation une coloration jaune-brun, puis feuille morte (Denigès [10]).

L’hydroquinol :chimiquement pur fournit les mêmes eristaux et les mêmes réactions.

5° Recherche de l’arbutoside par microsublimation chez diverses plantes.

A l’aide de la microsublimation, après hydrolyse préalable, Tunmann [42] a étudié l’Arctostaphylos Uva Ursi. Parmi les végétaux renfermant de l’arbutoside, la feuille de Busserolle présente pour nous comme plante officinale, un intérêt particulier. La sublimation réussit avec chaque feuille. Même les plus petites de 1 centimètre de long, du poids de 0,02 gr. suffisent pour obtenir 3 à 4 sublimés cristallins d’hydroquinol. La réaction peut donc être envisagée au point de vue pratique.

Les feuilles de Raïsin d’Ours, dont la consistance rappelle celle du cuir, sont difficiles à pulvériser. On peut se passer de cette pulvérisation compliquée en découpant la feuille en menus fragments, à partir de l’extrémité, à l’aide de petits ciseaux.

Ces petits brins sont humectés par 2 ou 3 gouttes d’acide chlorhydrique étendu et soumis à la sablimation. Les pétioles des feuilles, de même que les fragments de tiges, renferment de l’arbutoside en abondance.

Lors de notre expérimentation sur la Gesse noire, un échantillon de feuilles de Lathyrus niger Bernh., avec lequel nous avions fait des expériences il y a dix mois, était resté conservé dans un flacon de verre en présence de toluène; ces feuilles avaient pris une teinte jaune-brun. Lorsqu’elles furent sublimées directement, sans hydrolyse préalable, elles donnèrent déjà, à basse température, plusieurs beaux sublimés d’hydroquinol.