COLORANTS

Les colorants généralement employés sont de deux catégories : a) ceux qui donnent au protoplasma et au noyau une teinte iden-

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tique ; b) ceux qui colorent d'une manière différente le noyau et le protoplasma et permettent de les distinguer l'un de l'autre. a) Parmi les premiers, je recommanderai les suivants :

Bleu de méthylène boraté. — Une goutte ou deux d'une solution aqueuse de bleu de méthylène (2 p. 100) boratée (5 p. 100) est versée sur la lame. Au bout de trente secondes au plus, plongez la lame dans l'eau, lavez-la soigneusement, séchez-la au papier-filtre et ensuite chauffez-la doucement sur la lampe à alcool. Finalement, baume au xylol et lamelle.

Bleu de méthylène de Lœffler. — Solution alcoolique concentrée de bleu de méthylène 30 parties, solution de potasse caustique (1/10000) 100 parties. Colorez trente secondes, lavez à l'eau, séchez et montez.

Thionine phéniquée. — Solution alcoolique (60°) saturée de thionine 20 parties, solution aqueuse (2 p. 100) d'acide phénique 100 parties. Le mélange doit être préparé au moins quinze jours avant de s'en servir. Colorez cinq minutes, lavez et montez.

Hématoxyline et éosine. — Hématoxyline acide d'Ehrlich, ou solution forte d'hœmalum, cinq minutes ; éosine faible, une demi-minute ; lavez au robinet, puis à l'eau distillée ; séchez et montez dans baume au xylol. Cette méthode simple permet d'obtenir, avec une coloration moins intense, des préparations plus durables.

h) Les nombreuses méthodes permettant de colorer diversement le noyau et le protoplasme sont basées sur ce fait que, si l'on mélange des solutions de certaines sortes de bleu de méthylène et d'éosine, il se forme un troisième colorant doué d'une affinité spéciale pour la chromatine, qu'il teint en rouge. Toutes ces méthodes sont des modifications de celle imaginée par Romanowsky. Elles sont quelque peu incertaines et délicates, leur succès dépendant de la pureté des produits employés et d'un soin attentif des détails. Le commençant devra se familiariser d'abord avec les méthodes plus simples décrites ci-dessus. Lorsqu'il les possédera bien, il emploiera alors l'une des formes de la méthode de Romanowsky. Elle a pour avantage, non seulement de mettre en relief la structure intime de l'hématozoaire, grâce à la coloration intense du noyau qu'elle produit, mais aussi de faciliter la découverte des petites formes du parasite, chose parfois difficile, surtout dans le cas des jeunes parasites minuscules de la fièvre sub-tierce ou de la fièvre maligne. Parmi les trois méthodes que nous allons indiquer, celle de Leishman, tout compte fait, est la meilleure. Elle a l'avantage, comme celle de Jenner du reste, d'éviter le fixage préliminaire.

COLORATlOiy bV SANG.

Méthode de Romanomky. — La préparation sur lamelle est fixée par la chaleur à 110» pendant une heure. Elle est immédiatement plongée pendant plus de deux heures dans un mélange récemment préparé de solution aqueuse saturée de bleu de méthylène 2 parties, solution aqueuse d'éosine (1 p. 100) 5 parties, lavée à l'eau, séchée et montée. Le précipité formé par le mélange ne doit pas être filtré.

Colorant de Jenner. — Il faut avoir grand soin d'éviter toute trace d'alcali ou d'acide sur la lame où l'on a répandu le sang ; on aura donc lavé cette lame à l'eau distillée, puis on l'aura placée dans l'alcool absolu. Le colorant est préparé en dissolvant de l'éosine soluble dans l'eau (teinte jaune) et du bleu de méthylène médicinal de Grubler dans de l'alcool méthylique absolu qui doit être complètement exempt d'acétone et autres impuretés ; les solutions sont alors mélangées dans la proportion de 125 parties de solution d'éosine à 1/2 p. 100 et 100 parties de solution de bleu de méthylène à 1/2 p. 100. Le composé formé par le bleu de méthylène et l'éosine se trouve dans le commerce à l'état sec et peut Otre dissous ensuite dans l'alcool méthylique absolu. On répand quelques gouttes du colorant sur la lame et on recouvre pour empêcher l'évaporation et la précipitation. Au bout de trois minutes ou un peu plus, le colorant est rapidement rejeté, et la lame est lavée à l'eau distillée pendant cinq ou dix secondes, jusqu'à ce qu'elle prenne une teinte rose. Elle est ensuite séchée à la flamme ou à l'air et montée au baume xylol.

Colorant de Leishman. — Il y a deux solutions à préparer. A) Une solution à 1 p. 100 de bleu de méthylène médicinal (Grubler) dans l'eau distillée, rendue alcaline avec 0,5 p. 100 de carbonate de soude. Chaufîez-la à 65° G. pendant douze heures, et laissez-la à la température de la pièce pendant dix jours. B) Éosine extra B. A. (Grubler), 1 p. 1000 dans l'eau distillée. Mélangez parties égales de ^ et 5 et laissez ensemble six à douze heures, en agitant de temps à autre. Recueillez dans un filtre le précipité flocculent, et lavez-le à l'eau distillée. Séchez et triturez en poudre le filtrat, qui a un éclat métallique verdâtre, et contient la substance active du colorant de Romanowsky (cette poudre est en vente dans le commerce, en tablettes condensées appelées soloïds). Faites une solution à 0,15 p. 100 du colorant dans l'alcool méthylique et conservez en flacons bouchés.

Pour employer cette solution, versez-en trois ou quatre gouttes sur une préparation de sang non fixée. Après une demi-minute ou une minute ou davantage, ajoutez six à huit gouttes (ou davantage) d'eau distillée et mélangez-les en remuant la lame. Un précipité se forme immédiatement dans l'eau lorsque l'opération réussit. Après cinq minutes au moins, chassez l'excès de colorant avec de l'eau distillée, et laissez quelques gouttes d'eau au contact de la lame pendant plus d'une minute. Laissez sécher sans chauffer, et montez au baume de xylol.

Colorant de Giemsa. — Azur Il-éosine, 3 grammes; bleu azur II, O'^^S. Sécher, réduire en poudre et dissoudre dans 250 grammes de glycérine, ajouter ensuite 250 grammes d'alcool méthylique; chauffer à 40". Secouer le mélange, laisser reposer vingt-quatre heures et filtrer.

Fixer les préparations à l'alcool méthylique (trois minutes). La solution

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colorante se prépare en ajoutant une goutte du mélange ci-dessus à 1 centimètre cube d'eau dislillée à la température de 30° à 40". Plonger la lame dans cette solution pendant quinze minutes, laver au robinet, sécher et monter en baume.

Coloration des corps à flagelles. — On prépare une feuille de papier buvard épais, où l'on découpe des rangées de U'ous oblongs (2 centimètres et demi sur 1 centimètre et demi) ; on les humecte légèrement, mais suffisamment, avec de l'eau et on les applique contre un verre à vitres.

On choisit un malade dans le sang duquel abondent les formes en croissant. On piqiie le doigt, et on exprime une gouttelette de la dimension d'une grosse tête d'épingle. On prend une lame propre, on l'humecte avec l'haleine et on recueille la gouttelette de sang sur le centre de la surface ainsi humectée. Le sang est alors rapidement répandu à l'aide de l'aiguille, de manière à recouvrir une surface de 2 centimètres sur 1 centimètre. On renverse immédiatement la lame sur l'un des trous du papier buvard et l'on presse suffisamment pour faire bien adhérer, sans toutefois mettre le sang en contact soit avec les bords du papier buvard, soit avec la plaque de verre qui forme le fond de la petite chambre humide. Les autres cellules du papier sont rapidement couvertes d'autres lames préparées de la même façon. Après un à trois quarts d'heure, les lames sont retirées, séchées doucement à la flamme (la surface chargée au-dessus) et fixées à l'alcool absolu. Au bout de dix minutes l'alcool est séché, et quelques gouttes d'acide acétique faible (10 à 20 p. 100) sont versées sur la lame et laissées assez longtemps pour dissoudre complètement l'hémoglobine. Les lames sont ensuite lavées à l'eau et séchées. Elles peuvent alors être colorées par des réactifs variés. Jusqu'ici j'ai obtenu les meilleurs résultats avec de la fuchsine phéniquée faible (20 p. 100) laissée en contact prolongé. On verse le colorant et on le recouvre d'un verre de montre : après six à huit heures, on le chasse avec de l'eau chaude, on sèche la lame et on appUque une lamelle avec du baume au xylol.

En examinant avec un objectif 1/12 à immersion des préparations colorées au bleu de méthylène (1), les noyaux des globules blancs apparaissent très foncés, le protoplasme de ces globules à peine teinté, tandis que les hématozoaires présentent une teinte intermédiaire, et ressortent sur les globules rouges moins colorés (fig. 2, 15, 19). L'addition d'éosine pour produire un contraste donne des résultats incertains; même en des mains expérimentées, les bonnes préparations sont exceptionnelles. Dans la pratique ordinaire, je ne saurais la recommander; elle est superflue, difficile et infidèle.

(1) Lorsqu'on ne se propose pas de conserver les préparations, il est inutile de les recouvrir d'une lamelle et l'objectif à immersion sera mis directement en contact avec la lame au moyen d'huile de cèdre. Go procédé suffit pour faire uu diagnostic, et épargne du temps et du matériel.