SUCRE AR

Cendres (méningite tuberculeuse) . 4 cc.

Urée (azotémie): 15. .p 024 0

Réactions colloïdales.

Benjoin colloidal Meter Bordet-Was- Sérman tie Ce

2e cas : L'examen du liquide est différé ou ne peut être fait que loin du lieu de son prélèvement. On devra prévoir, dans ces circonstances, les difficultés d'interprétation qui entourent les examens bactériologique et cytologique (fragilité des germes, culture d'éléments étrangers, digestion des éléments cellulaires). L'examen chimique sur les liquides clairs conserve, par contre, toute sa valeur.

N. B. — À tout renseignement diagnostic demandé on fera joindre des renseignements cliniques sur la date du début de l'affection, l’évolution du cas et les traitements intra-rachidiens pratiqués.

Le liquide de} 1er eulot.}y Le premier culot est étalé sur deux lames

ponction lom- à l’aide d’une pipette effilée. On sèche à l'air baire estcentri- eton fixe à la flamme. L’envoisera fait, les deux fugé 15 minutes frottis se regardant, une languette de papier à la mainou 10 séparant les deux lames. |

dans un cen- 1re lame : Examen microbien direct et trifugeur élec- formule cytologique.

trique. si pos- 2e lame: Ziehl ou recherche spéciale. sible dans des| 2: culot, | On décante partiellement, de manière à tubes de Ra- laisser 2 ce. de liquide environ au contact du vaut stérilisés. culot. On ferme le tube à centrifuger à la

lampe et on le joint à l'envoi précédent t.

(Cultures. Inoculations.)

1. Dans le cas d'un liquide suspeet de méningococcie, on ajoutera avec avantage au 2e culot, avant de fermer le tube, 1 cc. d’une solution stérile de glucose à 5 p- 100 (Legroux).

ANALYSES MICROBIOLOGIQUES r295

3° Les liquides décantés sont réunis dans un Liquides|tube à essai propre. On ferme le tube à la décantés. [lampe et on l’immerge 10 minutes dans l’eau bouillante. Sa conservation est assurée pour

plusieurs semaines (Sucre examen chimique).

N. B. — A défaut de matériel stérile, le premier culot et les liquides décantés seront seuls utilisés.

E. — Analyse microbiologique des sérosités.

On examine les exsudats non coagulables, purulents ou non, après étalement, fixation et coloration du culot de centrifugation, par la thionine, la méthode de Gram ou la méthode de Ziehl-Nielsen. Pour les exsudats fibrineux coagu-. lables, il est nécessaire de dissocier au préalable le caillot dans un ballon stérile contenant des billes de verre, ou de l'homogénéiser avec de la lessive de soude (méthode de Bezançon, Griffon et Philibert, méthode de Pétrof) ou encore de le mettre à digérer avec du suc gastrique artificiel (voir analyse du sang).

Les sérosités seront ensemencées directement ou après homogénéisation dans les milieux nutritifs ou dans les milieux spéciaux : gélose ascite pour le gonocoque, milieu T pour le pneumocoque, milieux de Petrof pour la tuberculose.

On inoculera les produits morbides au cobaye, dans la cavité péritonéale s'ils sont purs, sous la peau s'ils sont contaminés par des microbes étrangers.

La recherche des anticorps et des antigènes sera effectuée par les méthodes habituelles de la sérologie: déviation du complément, précipitation, floculation.

F.— Analyse microbiologique du lait.

Quelles que soient les précautions prises, tous les laits frais destinés à la consommation contiennent un grand nombre de microorganismes : bactéries, moisissures levures.

La plupart de ces germes sont des microbes saprophytes, mais il enestun certain nombre, comme le bacille tuberculeux, le Bacterium coli, des streptocoques, le Micrococcus melitensis qui sont pathogènes pour l'homme et qu'il importe de mettre en évidence par les techniques du laboratoire.

1° Recherche qualitative des microbes du lait. — a) Bacille tuberculeux. — On centrifuge pendant1/4 d'heure à 5.000 tours 25 centimètres cubes de lait, additionnés de 50 centimètres cubes d’eau stérile, on recueille la crème et on décante. On étale séparément le culot et la crème, sur des lames de verre. On fixe en plongeant la lame pendant quelques minutes dans l'alcool méthylique absolu après dessiccation à l’étuve, puis on colore suivant la méthode de Ziehl-Nielsen. On peut également employer une des méthodes d’ensemencement indiquées au chapitre de la tuberculose et l’inoculation au cobaye.

b) Bacterium coli.— Mêmes techniques que pour la recherche du Bacterium coli dans l’eau.

c) Micrococcus melitensis. — On recueille le lait aseptiquement dans des tubes stériles débouchés sous le jet de traite. Trois gouttes de lait sont ensuite ensemencées par tube de gélose inclinée qu'on porte à l’étuve et qu'on observe pendant 10 à 15 jours. On dilue une goutte du même lait chauffé 1/2 heure à 560 dans IX ou XIX gouttes d'eau distillée stérile contenues dans un verre de montre flambé, on ajoute IX gouttes d’une émulsion, dans l’eau distillée sté rile, d'une culture jeune d’un M. melitensis d’origine humaine, ce qui donne une dilution du lait au 1/20 ou au 1/30. On répartit dans des tubes de 6 millimètres de diamètre et après6 heures à l’étuve, 24-48 heures à la température du laboratoire, on observe les résultats macroscopiquement et microscopiquement (Sergent, Gillot et Lemaire, Séjournant).

20 Recherche quantitative des microbes du lait. a) Numéralion par les cultures. — On fait une série de dilu-

tons au 1/100, 1/1.000, 1/10.000, 1/100.000 dans l’eau sté-

ANALYSES MICROBIOLOGIQUES 297

rile, de lait bien homogénéisé par agitation et on incorpore 1 centimètre cube de ces dilutions dans un tube de gélose nutritive, liquéfiée à 459. On mélange intimement en roulant les tubes entre les doigts et on coule rapidement dans une boîte de Petri qu'on porte à l'étuve à 37° Après48 heures, on compte les colonies qui se sont développées à la surface des milieux et on rapporte à 1 centimètre cube. Certains auteurs préfèrent cultiver les germes du lait à 20° en boîtes de gélose ou de gélatine nutritives. On compte alors les colonies après 4 jours.

b) Numération directe des germes au microscope. — La méthode préconisée par Prescott et Breed consiste à étaler 0 cc. 01 de lait sur une surface de 1 centimètre carré d’une lame de verre. On sèche à l’air par agitation ou à l’étuve et on fixe en plongeant la lame pendant quelques minutes dans l'alcool méthylique absolu. On colore ensuite avec une s0lution aqueuse de bleu de méthylène. Il faut éviter d’employer un colorant alcalin qui a l’inconvénient d'’altérer la pellicule de caséine. On compte les bactéries au microscope avec l'objectif à immersion. Ilest indiqué de combiner objectif et oculaire de manière que le diamètre du champ microscopique soit exactement de O0 cm. 0016, correspondant à une surface deÜ cm?005. Chaque champ microsco-

pique correspond ainsi à de centimètre cube de l'échantillon de lait.

On compte les bactéries de 8 à 10 champs et on prend la moyenne, qu'il suffit de multiplier par 500.000 pour déterminer le nombre des bactéries contenues dans 1 centimètre cube de lait.

Bien qu'elle ne permette de déceler que les bactéries colorables par le bleu de méthylène aqueux, cette méthode très précise et très simple donne, dans la pratique, d’excellents résultats.

G. — Analyse microbiologique des urines.

Les urines destinées aux ensemencements et aux inocu-

lations doivent être recueillies aseptiquement par sondage de la vessie.

On recherchera directement les éléments cellulaires anormaux par l'examen, à l’état frais, d’une goutte de liquide entre lame et lamelle, ou après coloration du culot de centrifugation étalé et fixé sur des lames de verre. Une de ces préparations sera colorée à la thionine, une deuxième par la méthode de Gram et une troisième par la méthode de Ziehl-Nielsen pour la recherche des bacilles tuberculeux. Le culot de centrifugation servira également à l’inoculation sous-cutanée au cobaye et à l’ensemencement sur le milieu de Pétrof après traitement parla soude (voir tuberculose, chap. xxxvin).

Recherche du B. coli. — Ensemencer 1 centimètre cube d'urine fraîche dans 9 centimètres cubes d’eau peptonée. Ajouter ensuite une quantité suffisante d’eau phéniquée à 5 % pour que le titre de la solution soit de 0,85 à 1 p. 1.000. Porter à l’étuve. Si, après 24 heures, la culture est devenue trouble, on la réensemence dans un nouveau tube d'eau peptonée phéniquée. Huit heures après, réensemencer en bouillon ordinaire. Identifier Île microbe suivant les techniques habituelles (voir B. Coli, chap. xxxn1).

Technique spéciale pour la recherche du Sp. iclerohemorragiæ. — Recueillir aseptiquement 250 à 300 centimètres cubes d'urine. Centrifuger dans plusieurs tubes dont on recueille les culots. Examiner par le procédé à l’encre de Burri ou après coloration par les méthodes de Fontana et Tribondeau ou de Ravaut et Ponselle. A défaut de centrifugeur, on emploiera le procédé de P. P. Levy et Léobardy : Additionner l'urine fraîche de 5 à 6 centimètres cubes pour 100 de formol à 40 pour 100. Agiter. Verser dans de grands tubes 6 centimètres cubes d'alcool à 95 et 40 à 50 centimètres cubes d'urine formolée. Mélanger. Couvrir de ligroïne sur une épaisseur de 2 à 3 millimètres, boucher au liège. Agiter violemment pendant une minute. Laisser reposer en position verticale pendant 30 minutes. Prélever avec une pipette et verser dans un verre de montre la masse émulsionnée, sans aspirer le liquide sous-jacent. Déposer IT gouttes de l’émulsion sur des lames de verre bien flambées et refroidies. Ajouter IT à IIT gouttes

ns

ANALYSES MICROBIOLOGIQUES Par

d'alcool absolu, mélanger et étaler en couche mince ; sécher à l’étuve et colorer par le procédé de Fontana-Tribondeau.

H. — Analyse microbiologique des selles.

Examiner directement, entre lame et lamelle, une goutte de dilution de selle dans l’eau stérile, ou après coloration : thionine, Gram, Ziehl-Nielsen.

Pour la recherche des bacilles typhique et paratyphique, dysentérique, du vibrion cholérique et de l’amibe dysentérique, voir les chapitres relatifs à ces microbes.

Technique de Calmette et Guérin pour la recherche du bacille tuberculeux. — On pèse dans un flacon d'Erlenmeyer 30 grammes de matière que l’on mélange ensuite avec 55 centimètres cubes d’eau stérile et 15 centimètres cubes d'antiformine. On agite à plusieurs reprises eton laisse en contact pendant 3 ou 4 heures, puis on centrifuge, on ;décante, on recueille le dépôt dans un vase stérile et on le dilue dans 8 à 10 centimètres cubes d’eau salée physiologique. On le filtre à travers 2 ou 3 doubles de gaze stérile et on l'inocule à la dose de 2 à 3 centimètres cubes sous la peau, à 3 ou 4 cobayes, au voisinage de la région inguinale

Technique de Moreau. — Broyer dans un verre ou un mortier stériles 50 grammes environ de matières, en ajoutant peu à peu de la solution de chlorure de sodium à 25 p. 100, jusqu’à ce que la masse devienne semi-liquide. On filtre sur gaze et on répartit le filtrat dans des tubes à centrifuger qu'on remplit jusqu'aux deux tiers. Chacun de ces tubes reçoit ensuite 2 centimètres cubes d’un mélange d’éther sulfurique et de ligroïne à parties égales On agite et on centrifuge pendant 10 minutes à 4.000 ou 5.000 tours. Les micro-organismes étrangers sont en grande partie détruits par l’éther, et les bacilles tuberculeux sont rassemblés à la limite de séparation des liquides. On les recueille avec l’anse de platine pour les étaler sur lames et les inoculer au cobaye.

CGHAPPRRERAXN

CHARBON BACTÉRIDIEN. — CHOLÉRA DES POULES. — PASTEURELLOSES: — ROU GET. DU" PORC:

A.— Charbon bactéridien.

Examen à l’état frais : bâtonnet immobile. non cilié, formes en bambou. Capsulé seulement dans les humeurs de l'organisme ou dans les cultures en sérum liquide, enliquide cérébro-spinal ou autres milieux riches en albumines. Spores réfringentes hors de l'organisme vivant.

COLORATION. — Toutes les couleurs basiques. Prend le Gram. Coloration des capsules par la safranine ou par la méthode de Friedlander: violet de gentiane phéniqué, décoloration par l'alcool à 90° et lavage à l’eau distillée ; ou bien par la méthode de Jones : fixation à la flamme après séchage à l'air; coloration à chaud pendant 15 à30 secondes par une solution aqueuse à 2 p. 100 de violet de gentiane ; lavage rapide à l’eau ; passage pendant 6 à 10 secondes dans l’eau acidulée par l'acide acétique à 1 ou 2 p.100 ; dernier lavage à l’eau et examen direct au microscope.

On peut encore faire la double coloration des bacilles et des capsules d’après le procédé de Kaufmann on traite la préparation pendant quelques minutes par le bleu de méthylène alcalin de Lôffler, on lave rapidement à l’eau et on plonge pendant 4 minutes dans une solution à 0,25 p. 100 de protargol. La préparation ainsi différenciée est ensuite colorée pendant 5 à 10 secondes par un bain de fuchsine de Ziehl diluée à 1 p. 20 dans l’eau. Après un dernier lavage on examine. Les bacilles apparaissent colorés en bleu foncé, les capsules en rouge.

La coloration du sang se fait le mieux par le Gram-éosine. Celle des spores dans les cultures se fait par les méthodes indiquées au chapitre var (C).

CHARBON BACTÉRIDIEN 301

CuLTurE. — Elle s'obtient sur tous les milieux usuels légèrement alcalins ; pH limites — 6,0-8,5. pH optimum = 7.0-7,4.

Température optimum 30 à 40°, mais la croissance a lieu à partir de 15° jusqu'à 439. La sporulation n’a plus lieu entre 42 et 43‘.Le bouillon reste limpide. Les bactéridies y poussent en flocons formant de légères houppes qui tombent au fond des vases et se dissocient facilement par agitation.

Gélatine : liquéfiée, développement en méduse ou en branche de sapin.

Sérum coagulé : lentement liquéfié. Lait : coagulé, puis digéré.

Ne forme pas d'indol.

Les cultures en bouillon contiennent une hémolysine qui dissout les hématies de lapin ou de mouton et aussi, mais un peu moins vite, celles des autres mammifères

Détruit le glycogène in vivo et in vitro Saccharifie légèrement l’amidon et attaque le glucose en formant des acides lactique et acétique.

Produit dans les milieux de culture un ferment protéolytique très actif qu'on sépare en tuant les bactéridies par le toluol et en centrifugeant le liquide (sans filtrer).

Les bacilles non sporulés sont tués par 40 minutes de chauffage à 55° dans les cultures ; par 1 heure de chauffage à 50-55° dans le sang frais.

Les spores sont tuées seulement après 10 minutes à 95° dans la vapeur d'eau, après 3 minutes à 100»

RECHERCHE DE LA BACTÉRIDIE CHARBONNEUSE DANS LES PRODUITS ORGANIQUES. — Les prélèvements de sang et de fragments viscéraux doivent être effectués le plus tôt possible après la mort pour éviterles infections secondaires, par le vibrion septique particulièrement. On examinera les frottis colorés suivant une des méthodes indiquées ci-dessus et on cherchera à identifier la bactéridie par les cultures en gélose et bouillon et par inoculation sous-cutanée ou intracutanée au cobaye.

Pour l'envoi de produits charbonneux, il est recommandé de prélever un métacarpe ou un métatarse dont la moelle osseuse renferme des bactéridies à l'état de pureté, même lorsque les cadavres dont ils proviennent sont en voie de putréfaction. Il suffit ensuite de scier l’os perpendi-

culairement à sa longueur, de cautériser à la flamme ou au fer rouge la surface de section et d’aspirer avec une pipette stérile une petite quantité de moelle qu'on ensemence dans un tube de bouillon ou qu'on étale à la surface d’un tube de gélose.

COLORATION DES COUPES D'ORGANES D'ANIMAUX CHAR- BONNEUX. — Enlever la paraffine avec le xylol, puis alcool absolu, eau. Brasiline, eau ordinaire, solution aqueuse de violet de gentiane, liquide de Lugol, alcool acétone presque à décoloration, eau ordinaire, aurantia, alcool à 50°, 100e, xylol, baume, lamelles.

RÉACTION DE PRÉCIPITATION D’ASCOLI. — On additionne les produits suspects finement broyés (rate, foie, etc.) de 4 à 5 fois leur poids d’eau physiologique et on fait bouillir pendant 5 minutes, On filtre à froid sur papier jusqu'à ce que le liquide devienne clair. Dans un petit tube à essai de 3 à 4 millimètres de diamètre, on verse 0 cc. 5 de sérum précipitant anticharbonneux, puis avec une pipette à effilure très fine, on ajoute dans le même tube 0 cc. 5 du filtrat précédent, en prenant la précaution d'appliquer l’extrémité de la pipette contre la paroi du tube pour que les liquides restent nettement superposés. Si les organes proviennent d’un animal mort de charbon, un trouble annulaire caractéristique se forme à la surface de contact des deux liquides.

B. — Choléra des poules. Pasteurelloses.

COLORATION. — Facile avec toutes les couleurs basiques, thionine phéniquée. Ne prend pas le Gram. Pôles plus colorés, centre clair (Pasteurella).

CULTURE. — Très facile dans les bouillons légèrement alcalins, bouillon de veau ou de poule qu’il trouble dans toute leur masse. En gélatine, ne liquéfie pas. Colonies petites, transparentes, en gouttes de rosée. Ne pousse pas sur la pomme de terre (caractère différentiel avec les microbes de la typhose aviaire). Le microbe du choléra des poules, comme la Pasteurella du lapin et les Pasteurella

PASTEURELLOSES 303

humaines, ne pousse pas dans l’eau de levure. Pour les différencier on ensemencera un milieu liquide préparé de la manière suivante (Staub et Truche) : :

Délayer 100 grammes de levure de boulangerie dans un litre d’eau de conduite en ajoutant l’eau peu à peu Faire bouillir pendant 5 minutes. Filtrer sur papier double. Verser le filtrat dans un ballon et stériliser à 110°-112° pendant 15 minutes. Laisser déposer pendant 15 jours, décanter et répartir le liquide clair.

Ce milieu ne doit être ensemencé qu’à partir d’une culture sur gélose ou en bouillon. Le microbe de la typhose aviaire s'y développe abondamment, de même que le Bacterium coli ; la Pasteurella du choléra des poules ne s’y développe pas:

Pour l’ensemencement des produits organiques, il est préférable de prélever un os long, une patte désarticulée ou coupée au-dessus de l’articulation tibio-tarsienne. On sectionne transversalement l'os à l’aide d'un costotome ou d'un sécateur, on brûle à la flamme la surface de section et on plonge une pipette stérile dans le conduit osseux pour aspirerune petite quantité de moelle qu’on ensemence ensuite sur de la gélose Martin ou du bouillon Martin. On peut se contenter de plonger un fil de platine flambé dans la moelle et de le promener à la surface de la gélose inclinée. On porte ensuite à l’étuve à 37° {Truche).

Le virus, détruit en quelques minutes à 58°, résiste à la glycérine. On peut conserver virulents pendant plusieurs mois (surtout à la glacière) des fragments un peu volumineux de rate immergés dans la glycérine pure à 30° Bé.

Nota : C’est dans le filtrat d'une culture en bouillon du choléra des poules que Pasteur découvrit la première toxine

soluble, en 1880.