H.— TECHNIQUE DE L'ISOLEMENT DES « BACTÉRIOPHAGES

(d’après d'Hérelle).

Un appareil à filtration sur bougie Chamberland E, ou L; est indispensable pour les liquides non stériles. Si le matériel dans lequel on recherche le bactériophage est limpide, on le filtre sur une bougie. S'il présente un trouble homogène abondant, on le clarifie, au préalable, de la manière suivante. Dans un verre d’eau ordinaire, on ajoute une forte pincée de terre d'infusoires. On agite et on verse la suspension d’un seul coup sur un entonnoir garni d'un filtre plissé. À mesure que le liquide s'écoule, le papier se recouvre d’une mince couche de terre d'infusoires, sur laquelle on passe ensuite la suspension à essayer. Le liquide clair ainsi obtenu est finalement filtré sur bou-

S'il s’agit d’un liquide tenant en suspension des particules organiques, ou de matières plus ou moins compactes (déjections, fumier, débris d’organes), on les désagrège, au préalable, en les émulsionnant grossièrement dans 10 à 20 parties de bouillon qu’on abandonne à l’étuve pendant 12 à 18 heures. On filtre ensuite successivement sur papier garni de terre d’infusoires, comme précédemment, et sur bougie.

Pour rechercher le bactériophage contre le bacille de Shiga par exemple, on ensemence quatre tubes de bouillon Martin avec une culture de 24 heures sur gélose. On ajoute dans le premier tube une goutte de filtrat, dix dansle second,

MICROBIOLOGIE 29

2 centimètres cubes dans le troisième, puis on les porte à l'étuve à 37° ; le quatrième sert de témoin. Suivant l’activité du bactériophage, un ou plusieurs tubes restent limpides après 12-18 heures. Cependant il convient de rechercher l'agent lytique, même lorsque tous les tubes de culture sont troubles. On décèlera sa présence en étalant une anse de chacune des cultures en bouillon sur tubes de gélose qu'on porte ensuite à l’étuve. Si le bacille dysentérique se développe alors normalement, la recherche du bactériophage peut être considérée comme définitivement négative. Quand il existe, la couche bactérienne présente un aspect varié : aspect déchiqueté, à bord corrodés, colonies isolées ou plages nues. S'il est très abondant, la gélose reste indemne de toute culture apparente.

Lorsqu'on se propose de vérifier l’activité d’un bactériophage à l'égard de plusieurs germes, on fait autant de séries de quatre tubes de bouillon qu'on ensemence, etonadditionne de filtrat comme précédemment.

Numération des ultramicrobes bactériophages.

— Chaque plage nue, qui apparaît dans une culture sur gélose additionnée de filtrat. correspond à un point où, pendant l’étalement, s'est déposé un élément bactériophage actif. Pour démontrer ces éléments, on prépare, une fois pour toutes, des tubes étalons contenant 100, 200, 300 et 400 millions de bacilles de Shiga par centimètre cube; on ajoute une goutte de formol dans chaque tube qu’on scelle ensuite au chalumeau. L'émulsion destinée à la lyse doit être préparée, de préférence, avec des bacilles provenant d'une culture de 24 heures sur gélose ; elle est facilement obtenue en versant dans le tube 1 ou 2 centimètres cubes de bouillon dont on laisse s’imbiber la couche microbienne en inclinant le tube pendant quelques minutes. Agiter ensuite et prélever avec une pipette une petite quantité de cette émulsion concentrée qu'on versera goutte à goutte dans un tube de bouillon jusqu'à ce que l’opacité devienne intermédiaire entre celle des tubes étalons contenant 200 et 300 millions de bactéries par centimètre cube. Soit un tube contenant 10 centimètres cubes de cette émulsion de bacilles de Shiga. On l'additionne de 1/50.000 d’une culture de bac-

tériophage âgée de 10 jours, c’est-à-dire d'une émulsion de

Shiga lysée depuis 10 jours. On agite pour bien répartir la semence et on prélève avec une anse de platine 1/100 de centimètre cube de l’émulsion qu'on étend uniformément sur un tube de gélose. Etuve à 37°. Après 18 heures, on observe par exemple 51 plages dans la couche microbienne. Le calcul est alors simple. Chaque centimètre cube de l’'émulsion a reçu 1/50.000 X 10, soit 1/500.000 de bactériophage, dont on prélève ensuite 1/100, soit 1/500.000 X 100 — 1/50.000.000 donnant 51 colonies provenant d'autant d’ultra-microbes bactériophages, soit pour 1 centimètre cube

51 > 50.000.000 — 2.550.000 germes lytiques.

Exaltation de l’activité du bactériophage.— Quand l'ensemencement sur gélose décèle la présence d’un bactériophage dans une émulsion en bouillon, on filtre celle-ci sur terre d'infusoires, puis sur bougie. On prépare une émulsion faiblement louche de la bactérie vis-à-vis de laquelle le bactériophage s’est montré actif; on y ajoute 4 à 5 gouttes de filtrat et on laisse à l'étuve, à 370, pendant 24 heures. Si la lyse n'est pas complète, on filtre cette seconde émulsion, on introduit 3 à 4 gouttes de filtrat dans une suspension légère de la même bactérie et on continue ces passages jusqu’à ce que le milieu devienne clair. À chaque repiquage, on recherche l'abondance du bactériophage en ensemençant un tube de gélose avec l’émulsion eten comptant le nombre des plages qui apparaissent dans la couche microbienne.