E. — COLORANTS COMPOSÉS

Ces colorants, en mélanges plus ou moins neutralisés, de telle sorte que chaque couleur garde pourtant ses propriétés électives, sont d’un emploi commode, surtout pour l'étude du sang. Leur préparation est assez délicate. Il est avantageux de les acheter tout faits. Les solutionssontinaltérables, pourvu qu’on les tienne en flacons bien fermés, à l'abri de la lumière.

a) Mélange d'Ehrlich-Biondi-Heidenhain.

On prépare séparément des solutions aqueuses saturées de fuchsine acide (Rubine S.), orange G. et vert méthyle. On les mélange dans les proportions suivantes pour faire la solution mère :

Hnehsinelacide PR eee 6 mé 4 cc.

OA DET OS CR RE D RE en 1 UE à fece Mertimetbyle SEPT LAS SPAS à 8 ce.

Pour l’usage, on verse 1 centimètre cube de cette solution mère dans 50 centimètres cubes d’eau distillée.

L'action est lente (24 heures). On porte ensuite les préparations pendant 2 heures dans de l'alcool additionné de 2 p. 100 d’acide acétique, puis on déshydrate par l'alcool absolu acétique (acide acétique 1 centimètre cube p. 100 centimètres cubes d'alcool absolu), enfin on passe au xylol. La chromatine est ainsi colorée en bleu, le protoplasma en rouge.

b) Triacide d'Ehrlich. Composé des mêmes colorants que le précédent, mais en proportions différentes :

Solution saturée d’orange G. . ASTON 30 cc.

Solution saturée de fuchsine Acide + FT 6 ce Faugdistilléess 5j ‘sut OR nr 15 cc.

AICOOL Abe es CN SR EN, 15 ce.

On agite, puis on ajoute :

Solution saturée de vert méthylène. . . l2fce: Aleoo lat sait a MER EE AN 10"cc:

friveerine tu: 0 51 ANT PAPE Er à 0e 10 ce.

Même différenciation par l'alcool iodé acétique.

c) Colorant de Leishman. Sur la lame séchée, non fixée, verser un nombre de gouttes (8 à 10) suffisant pour recouvrir le frottis. Couvrir la lame, pour éviter l’évaporation de l’alcool, avec le couvercle d’une boîte de Pétri, ou la placer dans une boîte de Laveran Faire agir 30 secondes à 1 minute. Ajouter sur la lame un nombre de gouttes d’eau distillée neutralisée! double du nombre de gouttes de colorant. Agiter pour mélanger. Laisser colorer 5 à 10 minutes à l’eau de source ou à l’eau distillée.

Le colorant (marque RAL) est livré en solution Cut prête ou en poudre. Pour préparer le colorant avec la poudre, mettre cette dernière en solution dans l'alcool à 99 5 (pur et neutre) à raison de 2 gr. 5 par litre. Faire la solution à froid ou à l’étuve à 37° en agitant de temps en temps. Filtrer après 48 heures.

d) Colorant de May Grunwald (marque RAL.) Eosinate de bleu de méthylène. Verser sur le frottis non fixé 10 gouttes de liquide de May Grunwald, couvrir comme dans la Érn que de Leishmann. Après 2 ou 3 minutes, Sos 40 gouttes d’eau distillée neutralisée. Bien mélanger, laisser agir 1 ou 2 minutes, puis laver à l’eau distillée.

Ce colorant n’est pas propre à donner seul une coloration convenable des frottis. Il est destiné à servir de premier temps à la méthode panoptique de Pappenheim. Il sert à fixer la préparationetà mieux mettre en évidenceles éléments acidophiles et les granulations neutrophiles.

Il est vendu en solution prête pourl’emploi, ou en poudre. Dissoudre cette poudre dans l’alcool méthylique pur, à la dose de 2 gr. 5 par litre

e) Colorant de Wright (marque RAL.) Même technique que pour le colorant de Leishman.

1. La mauvaise qualité de l'eau distillée est la cause la plus fréquente d'insuccès dans tous les procédés de coloration, dérivés de la méthode de Romanowsky. Elle doit être par. faitement neutre, c'est-à-dire avoir une concentration en ions hydrogène de pH7. Or, l'eau distillée est généralement acide. Voici un procédé simple de neutralisation indiqué par Ponselle : un tube à essai d'environ 16 millimètres de diamètre, très propre et rincé à l'eau distillée, porte un trait au diamant ou au crayon gras à 10 centimètres cubes. On verse de l’eau distillée jusqu’au trait, on y fait tomber 4 gouttes de bromocrésol pourpre en solution aqueuse à 0,04 p. 100 et on agite. Le liquide prend généralement une teinte vert jaune ; on verse alors goutte à goutte, avec une pipette eflilée, en agitant après chaque goutte, une solution 1/100 normale de carbonate de soude jusqu'à ce qu’on obtienne une teinte violette. Cette eau est employée pour diluer les colorants avec l'indicateur qu’elle contient.

f) Colorant de Giemsa. Fixer la lame préalablement avec de l'alcool méthylique ou avec le colorant de May Grunwald (indiqué ci-dessus). Préparer dans une large éprouvétte, ou dans une boîte de Laveran, une dilution de colorant de Giemsa dans l’eau distillée neutralisée à raison de :

Pau: distllee PP NET RE re 10 cc Colorant de Ciemsa ve Or TRE 0 cc. 5

Plonger la lame, sans l'avoir séchée, dans la solution de Giemsa diluée, laisser colorer 10 minutesau minimum, laver à l’eau.

La fixation préalable de la lame peut être faite en se servant du colorant de Leishman. On fixe 30 secondes à 1 minute par quelques gouttes de colorant de Leishman pur. Au bout de ce temps onégoutte l'excès de colorantet, sans laver, on plonge dans la solution diluée. Cette méthode remplace la nouvelle méthode rapide de Giemsa et la solution de Leishman est employée comme le « Farbfixierenlüsung ». Elle donne d'excellents résultats avec les protozoaires.

Le colorant de Giemsa se vend sous deux marques :

Marque À, donne des colorations intenses, recommandée pour les colorations rapides.

Marque L, recommandée pour les colorations lentes ; il précipite moins rapidement que le colorant marque À.

Le colorant marque L est aussi vendu en poudre, ce qui est avantageux pour les transports ; cette poudre est mise en solution à raison de 0 gr. 76 dans un mélange de:

Alcool Reaque M she HE TRE M 15 gr.

Glycérine . . IMMO in, Fat 25 gr.

Le mélange est mis à l’étuve à 370 et agité fréquemment. Filtrer après 48 heures.

g) Panchrome de Laveran (bleu de méthylène, bleu de toluidine, azur et violet de méthylène, éosine). Ce colorant peut être employé en dilution de 1/2 centimètre cube dans 10 centimètres cubes d’eau distillée neutralisée, de la même façon que le colorant de Giemsa, après fixation du frottis par un des procédés décrits.

Ï peut aussi être employé seul, réalisant à la fois la fixaüon et la coloration de la lame.

Dans ce dernier cas, placer la lame à plat dans une boîte

de Laveran, verser sur le frottis 1/2 centimètre cube du colorant, recouvrir, laisser agir comme fixateur pendant 3 minutes, ajouter 10 centimètres cubes d’eau distillée, mélanger, laisser colorer 10 à 20 minutes au moins (1/4 d'heure pour les protozoaires).

h) Panchrome de Pappenheim.

1° Fixer le frottis à l'alcool méthylique ou avec le colorant de May Grünwald. |

20 Egoutter la lame etla plonger, sans la sécher, dans une dilution du panchrome de Pappenheim préalablement préparée à raison de :

Panchrome de Pappenheim. . . . . . 1/2 ce.

Eau distillée neutralisée. . . . . . . 10 ce.

Laisser colorer 15 à 20 minutes. Laver et sécher.

IT. Colorants non anilinés. électifs des noyaux cellulaires.

A. — HÉMATÉINE ET HÉMATOXYLINE

a) Hématéine alunée de Mayer (colorant nucléaire). Eau jf es NES ARMES APAUE UNS EDOUCT

Alun de potasse. ttes de Et 2e 50 gr.

Chauffer jusqu'à dissolution de l’alun, puis ajouter :

Hématéinc, VIMAMENT AR 1 gr. dissoute dans:

Alcoôl;absolu 416 me MERS Urec:

Mélanger, laisser refroidir, filtrer. Laisser vieillir avant l'usage, mais pas plus d’un mois, car le mélange rougit à la longue et colore bien moins. On peut garder séparément les deux solutions.

b) Hématoxyline Delafield.

À 400 grammes d’eau saturée d’alun ammoniacal, on ajoute 4 grammes d’hématoxyline cristallisée, dissoute dans 25 centimètres cubes d'alcool absolu. On laisse reposer à la lumière et à l’air pendanttrois jours dans une capsule. On filtre et on ajoute 100 grammes de glycérine et 100 grammes d'alcool méthylique. On abandonne au repos pendant plusieurs

PRINCIPALES MATIÈRES COLORANTES fa

jours dans un flacon bouché. Quand la solutio n est devenue très foncée, on filtre de nouveau et on répartit en plusieurs flacons bouchés.

c) Hématoxyline de Weigert (laque cuprique).

On mordance les coupes par immersion pendant 30 minutes dans une solution d’acétate de cuivre à 1 p. 100. On colore par :

Hématoxyline de Heidenhain. . . . . 0 gr. 50 BRU Re T0 te a 1100. CC:

Puis on différencie par la solution suivante :

Borate de soude. Ne: 2 gr.

Ferrocyanure de potassium. ge ra 2 gr. 50 Han distiliéé re 200 cc.

Si les coupes sont surcolorées, on les passe rapidement dans l'alcool chlorhydrique :

AICOOI PAS TU RE EL EST tn 1 litre OT EX A XIII St,

Puis on lave à l’eau distillée, déshydrate, etc.

d) Hématoxyline au fer (laque ferrique).

Mordancer les coupes sur lame pendant 30 minutes à 24 heures dans la solution suivante :

Alun de fer ammoniacal (sulfate double

d’ammoniaque et de FRS de fer). 13 gr:

Eau distillée . . Rs 100 ce.

Laver rapidement, puis colorer pendant 24 heures par une solution à 0, 5 p. 100 d’hématoxyline de Heidenhain. Quand la teinte est uniformément noire, on rince à l’eau et on différencie doucement et plus ou moins longtemps par la solution d'alun de fer ammoniacal, jusqu'à ce que les noyaux et centrosomes apparaissent au microscopeen bleu noir. Onarrête la décoloration par lavage à l'eau lorsqu'on la juge suffisante.

B. — CARMIN (colorant nucléaire, réactif de la chromatine).

a) Carmin chlorhydrique. Mettre dans une capsule de porcelaine 1 gramme de carmin. Ajouter peu à peu le mélange

Acide RER ce APE NS let ETES

Eau distillée. . . den 2: CC-

en agitant avec une baguette de verre jusqu'à formation d’une bouillie homogène violacée. Laisser au repos 1 à 2 heures, puis ajouter :

Alcool à 940, en A MIT ER RME RU 200 ce.

Verser dans un ballon à fond rond bouché à l'ouate, taré etévaporer jusqu'à réduction de moiïtié. Eviter l’inflamma-

tion des vapeurs sortant du ballon. Répartir ensuite en flacons bouchés à l’émeri pour conserver.

b) Carmin de Orth.

Sol. saturée à froid de carbonate de lithine. 100 ce. Carine CAR EN Re 2 gr. 50

Pour donner l'élection, traiter la coupe (après coloration) 15 à 30 secondes par :

Acide PEER + + VHENTREUE 0 ec. 5 Fate RE Re 5 50 cc.

Picrocarmin de Orth.

Carmin de Orth,, Kthiné. … . . .! 1 vol.

On mélange :

Eau picriquée saturée. . . . . .:. . 1à2 voi.

Après coloration, les coupes sont portées dans le fixateur suivant :

AlCOO( ADsOlL EE toc au picriquée saiurée. 0 00 CT 30 cc.

HEC que #5, SAISON IE GROONÉ TENTE 0 gr. 5

c) Picrocarmin de Ranvier. Dissoudre du carmin à saturation dans de l’ammoniaque et verser dans une solution aqueuse d'acide picrique saturée.

Chauffer doucement au bain-marie dans une capsule pour évaporer jusqu'à réduction aux 4/5 du volume primitif (donc évaporation 1/5 en poids). Après refroidissement, filtrer sur. papier et évaporer à siccité. Le résidu d'évaporation est le picrocarmin qu'on peut conserver en poudre et utiliser ensuite en solution aqueuse à 1 p. 100. Colore en rouge les noyaux, en orange le protoplasma.

d) Picrocarmin de Jensen.

1° Carminate de magnésium (P. Mayer) : dissoudre 1 gram-

me decarmin et Ogr. 1 d'oxydede magnésium dans 50 centimètres cubes d’eau distillée, faire bouillir pendant 5 minutes. Après refroidissement, filtration, addition de 0 cc. 5 d'acide phénique.

2° Picrate de magnésium (P. Mayer): verser Ogr. 5d'acide picrique et 0 gr. 5 d'oxyde de magnésium dans 50 centimètres cubes d’eau distillée. Faire bouillir pendant 5 minutes, laisser refroidir et filtrer.

3° Solution à 1 p.100 d'acide picrique dans l’eau distillée. On mêle alors 1 avec 2 et on ajoute lentement 10 centimétres cubes de la solution d'acide picrique en agitant le mélange. Il se forme un liquide colorant tout à fait limpide, d'un rouge foncé, qui se conserve pendant des mois.

Les noyaux sont colorés en rouge, le protoplasma en orange, les muscles et le sang en jaune et le tissu conjonctif en rose.

CG. — ENCRE DE CHINE, OU DE BURRI (marque RAL)

Encre de Chine spéciale, très commode pour rechercher les tréponèmes et les spirilles sans coloration (voir plus loin, même chapitre F).

Au lieu de l'encre RAL on peut employer dans les mêmes conditions l'encre américaine de Higgins.

IIT. Méthodes usuelles de coloration des microbes.