B — COLORATION DIFFÉRENTIELLE DES MICROBES

a) Méthode de Gram.

19 Pour les frottis, exsudats ou cultures.

Colorer 2 minutes par la solution de violet de gentiane phéniquée (ou par les violets 5ou 6 B, penta ou hexaméthylés, ou par le bleu Victoria, à l'exclusion de tout autre colorant).

Sans laver, verser sur la préparation la solution suivante (solution de Lugol-M. Nicolle) qu'on renouvelle 2 ou 3 fois en 2 minutes :

Solution de Lugol (forte) :

louée ANS Re DEL 1 gr.

Iodure de potassium. ALLO: DES POSE 2 gr.

Eau edistiliéen Er CESR ART LE 200 ce

Il se forme avec certains éléments chromatiques une combinaison (iodopararosaniline) insoluble dans l'alcool.

Décolorer à l’alcool à 95°, 10 secondes environ, laver à l’eau. Recolorer 30 secondes par la safranine. Laver à l’eau : essorer ; sécher ; xylol. Examiner dans une goutte d'huile à immersion ou monter au baume de Canada au xylol.

20 Pour les coupes :

Colorer 5 à 30 minutes dans la solution de violet de gentiane phéniquée.

Traiter 2 minutes (sans laver) par la solution de Lugol à l’iode, qu'on renouvelle jusqu’à ce que la décoloration soit complète. Laver à l’eau. Recolorer à la vésuvine (solution aqueuse à 1 p. 100) ou par le picrocarmin de Ranvier (solution aqueuse à 1 p. 100). Passer dans l'alcool faible à 60 p. 100. Laver à l’eau. Sécher. Xylol. Baume.

b) Méthode de Gram- Nicolle (recommandable).

1° Pour les nu exsudats, cultures :

Colorer 1 à 5 minutes dans la solution suivante, en chauffant doucement au-dessus de la veilleuse d’un bec Bunsen :

SJ Qi

Solution alcoolique de violet de gentiane . 10 cc. Éaueéphémaquée"àa 1p; 100 "LU" 100 cc.

Sans laver, verser sur la préparation quelques gouttes de solution de Lugol, qu’on renouvelle 2 ou 3 fois en 4 ou 6 secondes. Décolorer 8 à 10 secondes par l’alcool-acétone :

HICOOT A DSOID. EPP RU M4 3 vol.

AcétoneD FAURE NT ENS IL UM y; 1 vol.

Laver à l’eau. Recolorer 30 secondes par la solution aqueuse de safranine ou par le bleu de méthylène. Laver à l’eau. Essorer, sécher, etc.

2° Pour les coupes :

Colorer d’abord pendant 30 à 60 secondes par la solution suivante :

Carmin lithiné de Orth. RC RNE ET 5 5 vol.

Alcool à 95°. . . RE AE SE 1 vol.

Sans laver, traiter 5 minutes par la solution de violet de gentiane phéniquée (comme en a), puis solution iodée de Lugol 4 à 6 secondes. Décolorer8 à 10 secondes par alcoolacétone (1 partie d’acétone pour 2 d'alcool absolu) Traiter 1 à5 secondes par l'alcool absolu picriqué (saturé) jusqu’à ce que la couleur devienne jaune verdâtre. Laver à l'alcool absolu. Sécher, etc.

c) Méthode de Gram-Claudius.

Colorer les coupes pendant 10 à 15 minutes par le carmin de Orth alcoolisé, comme ci-dessus, puis laver à l’eau distillée.

Colorer 1 à 2 minutes dans une solution aqueuse de violet de méthyle à 1 p. 100, ou de violet de gentiane phéniqué.

Laver à l’eau, essorer.

Décolorer par le chloroforme, puis par l’essence de girofle, jusqu'à ce que la coupe ait pris une teinte rose. Eclaircir au xylol et monter au baume. Ou bien, pour les frottx : sécher au papier buvard, puis à l’étuve ; examiner dans une goutte d'huile à immersion. (Outre les microbes qui

prennent le Gram, on peut colorer ainsi le bacille du charbon symptomatique et le vibrion septique).

d) Méthode de Romanowski (modifiée par À. Plehn).

On laisse mürir quelques semaines une solution aqueuse à 2. p. 100 de bleu de méthylène médicinal (exempt de ZnC}) à laquelle on a ajouté 5 p. 100 de borate de soude. Mélanger 2 parties de cette solution avec une partie de solution aqueuse d'éosine à 1 p. 100. Quinze à trente secondes après que le mélange bien homogène a été fait, et qu'il s'est formé une pellicule irisée à la surface, on prélève du liquide en introduisant l'extrémité d'une pipette sous la pellicule, et on le transporte dans une boîte de Pétri ou un godet contenant. face retournée en dessous, la préparation à colorer. Au bout de 2 minutes, la coloration est terminée.

On lave à l’eau. On passe quelques secondes dans l'alcool à 900 et on revient rapidement à l'eau. Enfin on sèche au buvard et on monte dans l'huile de cèdre.

Pour les coupes, ce procédé est bon, mais seulement si elles n’ont pas plus de 5 microns d'épaisseur. Il faut les laisser sécher à l’air avant de monter dans le baume, au lieu de passer à l'alcool et au xylol.

e) Méthode de Giemsa (pour les coupes et pour les frottis d'organes).

Plonger la coupe pendant 10 minutes dans la solution suivante:

Jodureñdé "potéssitinr WEP SE N 2 gr.

Solution dé #LDROL ER RE 3 cc.

Eau /-distilée NE SN Er er 100 cc.

Laver à l'eau rapidement. Traiter pendant 10 minutes par une solution aqueuse d’hyposulfite de soude à 0,5 p. 100. Laver 5 minutes dans l’eau courante.

Colorer 2 à 12 minutes à la température de 370 à l’étuve par :

Solution de Giemsa,...: & 7.7 JC IU routes Pau -hstliéer PAL OMIS OANPORNSNRERNENS 10 ce.

Placer la coupe inclinée, la face tournée en bas pour éviter les dépôts. Renouveler le bain après la première demi-heure. Laver rapidement à l’eau distillée, puis passer

successivement quelques minutes dans chacun des bains suivants :

MA CELTIC Er 95 cc.

PS 0) FRS CORRE 1 ESA ae 5 cc.

D'PAteLORe APRES OT à C2 OR ARE EPS 107EC:

DEUID ER EL MT US ne Mo TIR 30 cc.

MSA CÉMODE ET 7 ea Cp RTS 30 cc.

NID Se RS MEUT vale a ct 10 ce.

d) Xylol pur.

Monter à l’huile de cèdre ou au baume.

f) Colorations des coupes de tissus par l'hématéine-éosine.

On doit avoir à sa disposition une batterie de tubes Borrel contenant :

19 Hématéine alunée de Mayer ;

2° Solution aqueuse à 1 p. 100 d’éosine, ou bien le mélange de Mann pour l’étude des protozoaires ou pour la recherche des corps de Negri dans la rage :

Bleu méthylène à 1 p. 100, sol. aq. . . . 35 cc Eosine à 1 p. 100, solution aqueuse. . 45 ce. Banidiahliées ane in ne 100 ce.

40 Alcool! à 70»;

59 Alcool à 90° ;

6° Alcool absolu ;

7° Xylol pur.

Les coupes fixées, déparaffinées, déshydratées, puis repassées à l’eau, sont d'abord plongées 5 à 20 minutes dans l'hématéine.

Laver abondamment dans l’eau. Examiner à un faible grossissement pour voir si la coloration est suffisante. Si elle est trop intense, différencier par l'alcool chlorhydrique, plus ou moins longtemps. Si elle est bonne, différencier seulement quelques secondes par l'alcool chlorhydrique et laver abondamment. On laisse les lames dans l’eau courante ou mieux dans l’eau additionnée de 1 p. 100 de carbonate de lithium pendant 10 à 20 minutes.

Colorer ensuite 1 minute dans l’éosine (ou bien de 10 minutes à 24heures dans le Mann). Laver abondamment à l’eau.

Différencier par l'alcool à 70°, puis dans l'alcool à 90° jusqu'à disparition de la teinte rouge diffuse. Déshydrater rapidement par l'alcool absolu. Essuyer le dessous de la lame

pour enlever l’excès d’alcool et plonger dans le xylol pur pendant 15 à 20 secondes, puis monter dans le baume de Canada ou dans l'huile à immersion.

g) Coloration au safran de Pierre Masson (méthode excellente).

Pour préparer la solution de safran, on fait bouillir dans 100 centimètres cubes d’eau distillée 1 gramme de stigmates aussi frais que possible. Après une heure d’ébullition on filtre sur papier et on ajoute au liquide 1 centimètre cube de solution de tanin à 5 p. 100 et 1 centimètre cube de solution commerciale de formolt.

Les coupes, fixées et hydratées par immersion dans l'eau après déparaffinage, sont colorées à l’hématéine alunée de Mayer comme ci-dessus, différenciées à l’alcool chlorhydrique, bleuies dans la solution de carbonate de lithium à 1 p. 100, lavées et colorées 1 heure dans la solution d'éosine à 1 p. 100, lavées et immergées pendant 10 minutes dans la solution de safran, puis finalement lavées, déshydratées et montées.

Les noyaux apparaissent en bleu foncé, les protoplasmas en rose saumon, les granulations éosinophiles en rouge vif, les fibres nerveuses, élastiques et musculaires en rose vif,

les fibres conjonctives, l’osséine et la chondrine en jaune d'or.

h\ Méthode au bleu polychrome de Unna (frottis et coupes).

Colorer dans le bleu polychrome pur (5 minutes à 12 heures à froid). Laver rapidement à l’eau. Différencier à l'éther glycérique de Unna étendu de 3 à 5 parties d’eau. Laver abondamment plusieurs minutes. Déshydrater à l'alcool absolu, rapidement. Passer au xylol et éclaircir à l'huile de cèdre avant montage.