CULTURE DU BACILLE DE LA DIPHTÉRIE

renée le sang de bœuf; on peut cependant utiliser le sang du mouton et celui du cheval.

Le sang de bœuf est ordinairement récolté à l'abattoir; quand l'animal a été abattu, la carotide est dénudée et sectionnée, le sang coule en jet et il est facile de recevoir ce jet dans de grands Cristalli soirs préalablement stérilisés au four à flamber. Il serait mieux d'introduire une canule stérile dans la carotide avec un ajutage (caoutchouc et tube de verre) ; mais, en général, les bouchers ne se prêtent pas à cette opération.

Quand le sang est recueilli, on place les cristallisoirs dans un endroit frais à l'abri de toute trépidation pour permettre la séparation du sérum et du caillot ; vingt-quatre heures après, on aspire dans des ballons pipettes le sérum séparé et on le répartit dans des ballons qu'on ferme aussitôt à la lampe.

Si le sérum était stérile, l'opération serait terminée : on aurait ainsi une provision de sérum. Malheureusement dans les opérations que nous venons de décrire, qui se passent dans des milieux septiques, des germes tombent dans les vases et il est nécessaire de stériliser le sérum. 11 existe pour cela deux procédés : on peut, après l'avoir séparé du caillot, le filtrer sur bougie Chamberland, ou bien le stériliser en chauffant les boules de verre, remplies de sérum et fermées à la lampe, trois fois à deux jours d'intervalle, à 58° pendant une heure.

Quand on veut préparer des tubes de sérum coagulé, on répartit le sérum stérilisé dans des tubes de verre qui sont chauffés à 80° ; pendant tout le chauffage, on les maintient très inclinés, presque horizontaux, pour augmenter leur surface libre qui servira à l'ensemencement. Pendant la coagulation, le chauffage doit augmenter progressivement mais lentement et ne jamais dépasser 80° pour conserver au sérum toute sa transparence.

Voici le procédé classique aujourd'hui tel qu'il est pratiqué à l'Institut Pasteur. Lœffler et d'autres auteurs ajoutent du sucre, de la glycérine ou des peptones au sérum du bœuf; il est bien certain que, sur le sérum ainsi complété, les bacilles poussent un peu mieux, mais d'autres microbes se développent aussi plus rapidement et gênenl les examens.

Si l'on veut préparer du sérum coagulé avec du sang d<- cheval, il sul'fil de prendre le sang à la veine jugulaire; on a ainsi un sérum qui est le plus souvent privé de germes et peut être employé saqs (il I ration, ni chauffage. Il faut bien savoir cependant que sur sérum de cheval coagulé le bacille de la diphtérie pousse moins l>i<iu que sur sérum de bœuf coagulé.

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Ensemencement sur sérum. — Purification. — Quand on veut préparer la toxine diphtérique, il faut obtenir un microbe diphtérique en culture pure, en partant de la fausse membrane humaine. Voici comment on opère : on prend un fil de platine assez fort, aplati en forme de spatule à Tune de ses extrémités. On le fait rougir à la tlamme d'un bec Bunsen ou d'une lampe à alcool pour le stériliser et on le laisse refroidir dans un tube flambé avant de s'en servir. Quand on veut recueillir de la semence, on promène légèrement la spatule du lil de platine à la surface d'une membrane diphtérique et l'on ensemence successivement trois tubes de sérum coagulé sans recharger la spatule. On doit faire sur chaque tube une dizaine de stries parallèles, sur toute la longueur du tube, de façon à bien étaler la semence. Dans la pratique, on n'étale jamais trop; les débutants ne font souvent qu'une ou deux stries sur chaque tube et s'étonnent de ne pas obtenir des colonies bien isolées; répétons donc qu'il faut bien étaler la semence sur les trois tubes.

Les tubes ensemencés doivent être placés dans une étuve à 37°. Après vingt-quatre heures, l'examen permet de constater que sur les deux premiers tubes ensemencés, les colonies sont très serrées et qu'il est difficile d'en trouver de parfaitement isolées, qu'en tout cas, elles sont souvent très rapprochées, tandis que sur le troisième tube ensemencé, il s'en trouve de parfaitement isolées.

Les colonies diphtériques se présentent, après vingt-quatre ou trente-six heures d'étuve sous forme de petites taches arrondies, blanc grisâtre, dont le centre est plus opaque que la périphérie. Mais il ne faut pas se contenter de les reconnaître par l'aspect, il faut s'assurer par l'examen microscopique que les colonies qui paraissent être diphtériques sont bien constituées par des bacilles ayant la forme d'un bâtonnet légèrement renflé aux extrémités, s'enchevètrant mutuellement à la façon d'un tas d'aiguilles; il faut colorer ces microbes et s'assurer qu'ils prennent le Gram.

Quand on a bien reconnu une colonie isolée, il importe d obtenir avec cette colonie la purification du microbe pour arriver à avoir une culture pure du bacille diphtérique.

Pour purifier un microbe, on pique la colonie reconnue diphté* rique avec un fin crochet de verre ou avec un fil de platine, on délaye soigneusement dans du bouillon les microbes qui sont restés adhérents au crochet, puis on agile vivement et longtemps le tube de bouillon. Cela fait, on trempe dansée bouillon, qui contient des bacilles en petite quantité répartis dans tout le Liquide, un lil de platine préalablement stérilisé et refroidi ; aussitôt sorti du bouillon, ou promène le lil de platine à la surface d'un tube de

sérum coagulé en faisant sur le tube de très nombreuses stries pour répartir les germes sur toute la surface, de façon à obtenir des colonies bien isolées. Le tube de sérum est placé à l'étuve à 37°. Après quarante-huit heures, on voit sur le tube de sérum des colonies très développées; avec le crochet de verre on prélève de la semence sur la colonie qui est la plus isolée et on ensemence un tube de bouillon qu'on met à l'étuve à 37<>. Après un séjour de vingt-quatre heures, on examine ce tube de bouillon pour bien s'assurer qu'il ne contient que des bacilles diphtériques, et qu'on a bien une culture pure d'un microbe provenant d'une fausse membrane humaine. Quand ce résultat est obtenu, on peut étudier les propriétés du nouveau bacille isolé et rechercher s'il produit de la toxine diphtérique.

La technique que nous venons d'indiquer est celle qui servit à MM. Roux et Yersin pour obtenir le poison diphtérique; nous l'avons empruntée à leurs mémoires qui parurent dan» les Annales de C Institut Pasteur en décembre 1888, juin 1889 et juillet 1890.

Bouillons de culture. — Pour obtenir la toxine diphtérique avec un microbe qu'on vient d'isoler d'une fausse membrane humaine, il faut faire des ensemencements sur milieux liquides; on doit savoir que la préparation des ces milieux liquides est soumise à des règles qu'il importe de bien connaître.

Mais avant de fixer le meilleur mode de préparation, voyons compilent M.M. Roux et Yersin ont opéré quand ils ont obtenu pour la première fois une toxine diphtérique active.

Dans leur premier travail (1888, page 642), ils indiquent comme milieu de culture le bouillon de veau ; dans le deuxième mémoire (1889, p. 27 i- . ils précisent en disant que ce milieu doit être légèrement alcalin. Dans ces conditions, le bacille diphtérique donne une culture peu abondante, caractérisée par la formation d'amas microbiens qui se déposent au fond des vases de cultures. Si L'on recherche la réaction du milieu, on voit que Le bouillon, d'alcalin qu'il était, jlevienl Légèrement acide, puis redevient alcalin après un temps plus pu moins long, suivant Les cas.Si Ton filtre sur bougie Chamberland le Liquide de culture et si on recherche son activité en L'injectant Bous La peau d'un cobaye, on voit que Le bouillon e^l inactif tant qu'il e^l acide et qu'il devient toxique quand L'alcalinité appa raît.

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MM. Roux et Yersin imaginèrent un procédé qui permit d'obtenir plus rapidement une toxine active, voici sa description (1) :

« Dans les conditions habituelles, il faut maintenir les cultures pendant des mois à la température de 37° pour que le poison s'y accumule. Un procédé plus rapide peut être recommandé : il donne des résultats plus constants; il consiste à faire la culture dans un courant d'air humide. On se sert de vases à fond plat, munis d'une tubulure latérale (vases de Fernbach), dans lesquels on met du bouillon alcalin peptonisé à 2 p. 100, de façon que la couche liquide ait une faible épaisseur. Après stérilisation à l'autoclave, on sème du bacille diphtérique récent, très virulent, et on porte à l'étuve à 37°. Lorsque le développement est bien commencé, la tubulure de chaque ballon est reliée par un tube de caoutchouc à un ajutage d'un tuyau de cuivre qui est lui-même en relation avec une trompe à eau. Au moyen de pinces à vis, placées sur les tubes de caoutchouc, il est facile de régler le courant d'air qui pénètre par le col de chacun des matras, après avoir barboté dans un flacon laveur. Cet agencement est préférable à celui qui dispose les vases de culture les uns à la suite des autres, et les fait tous traverser par le même courant d'air. Après trois semaines, un mois au plus, la culture est suffisamment riche en toxine pour être employée. Sur le fond des vases, on voit un fort dépôt de microbes, et, à la surface, un voile formé de bacilles plus jeunes. A ce moment la réaction est fortement alcaline. Tous les bacilles diphtériques, même lorsqu'ils paraissent également virulents pour les cobayes, ne donnent pas les mêmes quantités de toxine dans les cultures. L'essai de bacilles de diverses provenances fera reconnaître ceux qui fabriquent la toxine la plus active. Nous n'étonnerons aucun bactériologiste en disant que la force de la toxine n'est pas toujours la même dans des cultures faites, en apparence, dans des conditions identiques. Aussi est-il préférable de faire une provision de toxine qui servira pendant toute une série d'expériences, afin que celles-ci soient bien comparables entre elles.

Les cultures achevées sont Jiltrécs sur une bougie Chamberland. et, le liquide clair est gardé dans des vases bien remplis, bouchés et tenus à l'abri delà lumière, à la température ordinaire. Ainsi préparée, la toxine tue d'ordinaire un cobaye de 500 grammes en quarante-huit heures à la dose de 1 dixième de centimètre cube. Klle perd son activité à la longue, mais lentement si on la maintient dans les conditions que nous venons de dire. »

0) Annales de V Institut Pasteur, L894, p. 6H.

Avec le procédé que nous venons de décrire, on obtenait des toxines peu actives et surtout il y avait des irrégularités. Aussi les travailleurs ont-ils recherché les conditions qui favorisaient la production des toxines et, en précisant les expériences, ils ont vu que la production des toxines dépendait en grande partie :

1° de l'alcalinité primitive du milieu,

■2° de la persistance de cette alcalinité.

Alcalinité primitive des bouillons. — D'après MM. Houx et Yersin, le bouillon de veau devait être franchement alcalin; Park et Williams (1) étudièrent spécialement cette question et voici leurs conclusions : « Les meilleurs résultats sont obtenus avec du bouillon qui, après avoir été neutralisé, est additionné d'environ 7 centimètres cubes de soude normale par litre. »

Pour appliquer cette règle, il y a un point délicat : la neutralisation du bouillon ; pour l'apprécier on se sert comme indicateur de la teinture de tournesol. Il faut à l'avance préparer, comme point de comparaison, un tube contenant de l'eau distillée et trois gouttes de teinture de tournesol ; il donne la teinte neutre dont on devra se rapprocher autant que possible en alcalinisant le bouillon.

Quand on observe bien la règle posée par Park et Williams, on voit que le bouillon ensemencé avec un bacille diphtérique devient acide et que l'alcalinité apparaît vers le deuxième, troisième ou quatrième jour de la culture ; et, de ce fait, on constate parfois des irrégularités dans la production de la toxine; aussi a-t-on cherché quelle était la cause de cette acidité.

Corps qui favorisent la production d'acidité. — C'est le Dr G. Spronck, d'Utrecht (2) qui, le premier, mit en cause la glucose présente dans les milieux de culture et nous avons étudié avec le D1 Louis Momont (3) l'influence de différents corps.

.Nous avons vu, qu'à la dose de 5 grammes par litre, la glucose, la lévulose, la saccharose, la galactose, la glycérine favorisaient la production d'acide ; tandis que le glycogène, l'amidon, la lactose, la maltose, la raflinose, l'arabinose, l'érythrite, la dulcite et la mannite ne provoquent pas l'apparition de l'acidité.

Tous ces faits nous ont permis de conclure qu'en éliminant du bouillon tous les corps qui favorisent la production d'acidité, on jMiil obtenir un milieu qui reste toujours alcalin et dans lequel la toxine doit se produire rapidement.

Pour éliminer toute glucose, il importe d'avoir t\c> peptones

(I; The Journal of Expérimental Medicine, vol. I. p. I. Uj Annales de l'Institut Pasteur, 1895, |>. 758 [imales de l'Institut Pasteur, 1898, p. 39.

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qui n'en contiennent pas, il importe aussi de faire disparaître toute celle qui se trouve dans les viandes.

Pour avoir des peptones privées de glucose, le mieux est de les fabriquer soi-même au laboratoire.

Pour avoir des viandes sans glucose, il faut, avant de préparer des bouillons pour la diphtérie, détruire le sucre par fermentation ; pour cela on a proposé d'ajouter à la macération de viande de la levure et de placer le tout à l'étuve ; mais il est facile de se convaincre qu'il est inutile d'ajouter de la levure et qu'il suffit, pour faire disparaître toute trace de glucose, de placer la macération de viande vingt heures à l'étuve à 35°, en prenant toutefois la précaution de se servir pour faire la macération d'une eau chauffée à 37°.

Milieu de choix. — En recherchant les conditions favorables à la production de la toxine, nous avons proposé un milieu de culture qui donne de très bons résultats et qui est constitué par un mélange par parties égales d'un bouillon d'estomac de porc qui apporte la peptone et d'une macération de viande ; voici comment on opère :

Bouillon d'estomac de porc. — C'est une eau peptonisée qu'on produit soi-même avec des estomacs de porcs; ces estomacs, appelés panses dans le commerce, nous fournissent ce que nous appellerons pour plus de simplicité le bouillon de panse.

Pour l'obtenir, nous prenons des estomacs de porcs et nous broyons ou hachons ensemble les tuniques muqueuse et musculaire. Pour éviter autant que possible les variations qui pourraient survenir par suite de la quantité variable de pepsine de chaque estomac, nous prenons ordinairement cinq panses, pour une opération.

Plaçons ce hachis dans l'eau acidulée à 50°, dans les proportions suivantes :

Hachis d'estomacs de porcs 200 grammes.

Acide chlorhydrique pur 10 —

Eau à 50°....' J 000 —

L'eau doit être maintenue à 50°, car à cette température la pepsine de la muqueuse stomacale digère plus activement les tissus et les transforme en peptone (1).

Après douze heures, l'opération est généralement terminée; on peut sans inconvénient attendre vingt-quatre heures : dans ce milieu très acide, il ne se développe pas de microbes. Lorsque la digestion est achevée, on chauffé le bouillon d'estomac de porc à

(1) On peut sans inconvénient, pour améliorer le milieu et l'adapter à certains microl autres que le bacille diphtérique, meltreà digérer des organes, par exemple du poumon. d« intestins, du placenta ou des muscles; il y a suffisamment de pepsine pour digérer I» libres de l'estomac et les autres matières albumiaoldes.

10o\ on détruit ainsi la pepsine en excès ; puis on le passe au tamis ou mieux on le filtre sur une couche de coton hydrophile peu épaisse et peu serrée, on chauffe le liquide filtré et on Falcalinise au moment où le liquide atteint environ 80°. Dans le liquide, de gros flocons se forment qui le clarifient.

Après falcalinisation, on filtre le bouillon sur papier. Quelquefois le bouillon de panse est louche; si on chauffe à 120° cela n'a pas d'importance, car le bouillon se clarifie à Yautoclave. Si on veut seulement chauffer à 100°, il faut avoir soin de bien écume r le bouillon comme on écume un pot-au-feu, puis on le laisse refroidir et on enlève la graisse solide qui surnage. Si, malgré ces précautions, le liquide était louche, on le clarifierait sûrement en ajoutant, avant de Falcaliniser, un fragment de chlorure de calcium et immédiatement après un morceau de phosphate de soude.

Lue pratique meilleure est de chauffer la macération d'estomacs de porcs tous les deux jours à 100° ; après trois ou quatre chauffages, le liquide se clarifie très facilement ; ensuite chauffer à 120°, filtrer sur papier, répartir dans les vases de culture et stériliser en chauffant un quart d'heure à 115°.

Le liquide obtenu par cette auto-digestion de l'estomac est une véritable solution de peptone, dans laquelle le bacille diphtérique se développe bien, sans fournir d'acide; la peptone ainsi préparée donne des résultats plus constants que les peptones commerciales dont la composition est si variable.

Macération de viande. — Voici la technique que nous conseillons : hacher de la viande de veau, mettre 50 grammes de ce hachis par litre d'eau, chauffer à 37° et placer le tout à l'étuve pendant vingt heures, exprimer la viande et ajouter 5 grammes de sel marin par litre.

Mélange. — A cette macération de viande ainsi préparée, on ajoute parties égales de bouillon d'estomac de porc alcalinisé et filtré sur papier.

Le mélange par parties égales de macération de viande et de bouillon d'estomac de porc, est chauffé à 70° pour coaguler les matières albuminoïdes, puis filtré sur papier et neutralisé exactement; on ajoute alors les 7 centimètres cubes de soude, normale par litre el on stérilise par filtration sur bougie Chamberland, soif par chauffages discontinus à 100°, soif par chauffage à l'autoclave; quand

ron veut obtenir une toxine très forte, il vaut mieux stériliser par filtration, mais dans la pratique, il est plus -impie de se servir de l'autoclave.

Dans le milieu ainsi préparé,le bacille diphtérique ne pousse plu-

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en petits amas qui se déposent au fond du vase, mais les microbes, en se développant, forment un voile à la surface du liquide; dans les premiers jours le voile tombe et se reforme, après quinze jours le voile ne se reforme plus.

Avec le milieu que nous venons de décrire, on peut supprimer le courant d'air que préconisaient MM. Roux et Yersin, faire des cultures en profondeur et avoir cependant plus rapidement des toxines plus actives.

Milieux sans viande. — Beaucoup de travailleurs, pour étudier la production de la toxine diphtérique, ont essayé de préparer, pour le bacille diphtérique, une sorte de liquide Raulin dans lequel tous les éléments seraient dosables. On espérait ainsi suivre leur transformation et savoir desquels dérive la toxine diphtérique.

Les milieux qui ont été proposés ne permettent pas d'obtenir en général des toxines très actives, mais comme les essais pourront être améliorés, nous devons donner la composition des milieux les plus connus.

Milieux de M. Nicolle. — Maurice Nicolle a proposé un milieu qui contient différents sels, des peptones et de la gélatine liquéfiée par le subtilis ; voici sa formule :

Eau Q. S. pour porter à 1000 grammes.

Poptone Chapoteau ou de Aschmann 20 —

Sel marin 5 —

Phosphate bipotassiquc 2 —

Asparagine 2 —

Lactate d'ammoniaque 3 —

Phosphate disodique 1 —

Tartrate de potasse 1 —

Sulfate de magnésie 1 —

Gélatine liquéfiée par le subtilis 150 — (1 )

Dans ce milieu, la culture du bacille se fait pendant très longtemps et la toxicité augmente. Avec ce procédé, M. Nicolle a obtenu une toxine active au millième de centimètre cube après cinquante jouis de culture (Communication de l'auteur).

Ouchinski (2) avait proposé pour l'élude des toxines du choléra et de la diphtérie un milieu où tous les aliments étaient dosables ; voici sa formule :

0) Faire de la gélatine à l'eau lu p. 100, ajouter un dixième de bouillon, alcaliniser, répartir en flacons, stériliser, ensemencer avec une culture en bouillon de s uh/itis, enlever de l'étuve après trois à quatre jours.

(2) Ouchinski, Archives de médecine expérimentale, 1893, |>. 893.

Eau 1000 grammes.

Glycérine 30-40 —

Chlorure de sodium 0 —

Phosphate bipotassique 2^,5

Lactate d'ammonium 6&r,5

Sulfate de magnésium 0sr,3

Chlorure de calcium 0«'\ 1

Asparagine 3er,2

liugounenq et Doyon (1) répètent les expériences d'Ouchinski et trouvent : « que les résultats positifs avancés par l'auteur doivent êlie considérés comme tout à fait exceptionnels, du moins pour la diphtérie ».

C'est aussi l'avis de Iiadley (2) qui vient tout récemment de reprendre l'étude de cette question et qui propose d'ajouter du glycocolle pour obtenir un milieu plus parfait; voici sa formule :

Glycérine 3 grammes.

Chlorure de sodium 0sr,60

— de calcium 0sr,08

Sulfate de magnésie 0si\32

Phosphate bipotassique 0sr,23

Lactate d'ammonium 0&r,75

Glycocoile 0&r,10

Eau Q. S. pour 100 grammes.

Pour accoutumer certaines races réfractaires à un tel milieu, des quantités croissantes de celui-ci sont ajoutées à du bouillon. Hadley finit toujours par obtenir des cultures sur la solution glycocollée.

Choix du microbe. — Quel que soit le milieu de culture choisi, on remarque que tous les microbes ne donnent pas une toxine diphtérique également active. Non seulement on voit que les microbes virulents qui tuent rapidement les animaux donnent en général une toxine plus active que des microbes peu virulents; mais encore on trouve que, parmi les plus virulents, les uns donnent des toxines très actives, d'autres des toxines peu actives ; le pouvoir toxigène n'est pas absolument dépendant de la virulence. La conclusion qui découle de ces observations est que, dans ia pratique, on doil rechercher dans les microbes virulents quels sonl les plus toxigènes. On fait un choix et on examine ensuite quel est celui qui en dehors de l'organisme conserve le mieux ses propriétés toxigènes ; parfois on trouve des microbes très actifs Lorsqu'ils viennent d'être isolés et qui, dans la suite, ne conservent pas la fonction toxigène, il faut donc les éliminer.

(li II dhehq et l)o\<», Société de biologie, 18 avril 1896, p. SOI.

(2) Philippe B. Hadley, Journal of infect, diseases, supplément <lu 3 mai 1907, p. 95.

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Modes de eonservation du microbe. — Quand on a trouvé un bon microbe, bon producteur de toxine, et conservant cette propriété, il importe de le garder en culture en dehors de l'organisme.

Chaque laboratoire a ses méthodes; ce qui prouve du reste qu'il n'y en a pas d'absolument parfaites. Nous conseillons avant tout d'éviter les milieux dans lesquels les microbes produisent des acides.

Cette règle est généralement observée dans tous les laboratoires et voici quelles sont les méthodes les plus employées :

Kosenau (1) conseille les ensemencements journaliers sur sérum, sur agar ou sur bouillon.

A l'Institut Pasteur, nous ensemençons tous les deux jours en bouillon.

Malgré ces précautions, il arrive que le pouvoir toxigène diminue; nous indiquerons comment on peut le remonter; mais en général dans tout laboratoire on conserve de vieilles cultures qu'on doit rajeunir par deux cultures successives lorsqu'on veut s'en servir.

Nous employons des cultures sur sérum coagulé, les tubes sont ensemencés par stries, puis placés àl'étuve à 37° pendant quarantehuit heures. On les retire et on les laisse dans un local à température basse, 10°-12° et constante. 11 faut avoir bien soin de recouvrir ces tubes d'un capuchon de caoutchouc ou mieux de les fermer à la lampe. On peut aussi employer les vieilles cultures sur bouillon et les rajeunir au moment de s'en servir.

Spronck, usant d'un autre procédé, ensemence sur sérum liquide, qu'il met vingt-quatre heures à l'étuve à 37°, puis conserve la culture en dehors de l'étuve à l'abri de la lumière. Quand on veut reprendre le microbe, il faut le rajeunir; pour cela on l'ensemence d'abord sur sérum, et de ce sérum dans le bouillon qui doit servir à produire la toxine.

Augmentation du pouvoir toxigène. — Quand un microbe perd une partie de son pouvoir toxigène, on peut l'augmenter patdifférents procédés. Roux et Yersin, avaient conseillé pour augmenter la virulence d'un microbe, de l'associer au streptocoque, soi! en culture, soit en injections aux animaux; ce moyen peut servir pou* augmenter le pouvoir toxigène. On a aussi de bons résultats en pratiquant des passages par les animaux et en particulier par le cobaye. Enfin nous avons souvent remonté le pouvoir toxigène en plaçant dans le \ entre de lapins un sac de collodion rempli de bouillon ensemencé avec du bacille diphtérique; après quelques passages, le microbe devient très toxigène.

(1) Rosenau, The imraunity unit for standarizing Diphteria antitoxin [Hygitnic laboratorjf

lit, IL. avril 1905, "" il).

Culture du bacille diphtérique sur bouillon. — Quand on ensemence un microbe toxigène sur le milieu de choix, panse et macération de viande, on voit qu'après vingt-quatre heures, un voile s'est formé à la surface du bouillon; après quarante-huit heures, des lambeaux se détachent de la surface et plongent dans le bouillon, mais sont aussitôt remplacés par un nouveau voile, et ainsi pendant huit jours; puis le voile ne se reforme plus et la culture s'arrête vers le quinzième jour. Si l'on recherche l'activité de la toxine en filtrant sur bougie Chamberland la culture du bacille diphtérique, on voit que la toxine est formée dès la fin du premier jour. Les jouis suivants la toxine augmente jusqu'au huitième jour, reste stationnaire du huitième au quinzième jour, pour décroître ensuite si on laisse les ballons à l'étuve.

Il n'est pas indispensable de filtrer la toxine, on peut laisser les i Microbes tomber au fond du vase et décanter le liquide surnageant.