TECHNIQUE

Les matériaux employés pour ces recherches ont été récoltés à des altitudes très diverses variant entre le niveau de la mer et 3 000 mètres.

Les échantillons de plaine ont pour lieux d’origine Lille, Valenciennes, Chantilly, le jardin du Muséum d'Histoire naturelle, Ris-Orangis (Seine-et-Oise), Villebon-Palaiseau (Seine-et-Oise), Fontainebleau, Saint-Romain-sous-Versigny (Saône-et-Loire), Toulon-sur-Arroux (Saône-et-Loire), La Boulaye (Saône-et-Loire), le Pare de la Tête-d'Or à Lyon et Bagnères-de-Bigorre.

Ceux de montagne ont été récoltés, pour les Pyrénées, dans toute la région du Pic du Midi de Bigorre et, en particulier, à Artigues (1 200 m.), à Pène Blanco (2 000 m.), au col de Sencours (2 500 m.) vers le lac d'Oncet (2 200 m.) près de l'Observatoire (2 860 m.), à la Table d'Orientation du Pic (2877 m.); pour les Alpes, les environs du Lautaret et plus spécialement la vallée de la Romanche, le pied du Col (1 800 m.), le Villars-d’Arène (1 800 m.),le col du Lautaret (2 050 m..), le Jardin alpin (2 100 m.), l’Alp du Villars-d’Arène (2 100 m.), le bois de la Madeleine entre 1 770 et 2 000 mètres, Prime-Messe entre 1800 et 2000 mètres, le Galibier (2 600 m.); en Savoie, la région du Massif de la Vanoise (Pralognan, 1 500 m.), le cirque de l’Arcelin, le Bochor, ete...) ; en Haute- Savoie, la vallée de Chamonix (1 000 à 1 200 m.), les moraines du glacier des Bossons, Saint-Gervais (800 m.), Le Fayet, Les Contamines (1200 m.), le mont Joly, la vallée de l’Armancette (1 800 m.), le glacier de Tré-la-Tête (2 000 m.), etc.

Comme matériaux, j'avais d’abord récolté, pendant mon premier séjour dans les Pyrénées, des fleurs épanouies. Mais J'ai remarqué que de telles fleurs étaient des échantillons

insuffisants pour une étude anatomique. En effet, pour certaines espèces, le calice tombe à l’épanouissement de la fleur; de plus, très souvent, la corolle offre après l’anthèse un commencement de désorganisation de son mésophylle, les deux épidermes des pétales et les petits faisceaux libérohgneux restant seuls bien conservés; enfin les étamines vidées plus ou moins complètement et les stigmates présentent aussi, après l'épanouissement de la fleur, des déformations et des altérations.

Pour ces différentes raisons, j'ai récolté pour ces recherches des boutons floraux aussi près que possible de leur épanouissement. Toutefois, j'ai employé les pétales des fleurs épanouies pour l’étude des papilles qui s’y trouvent bien plus développées que dans le bouton.

Pour obtenir des coupes ayant toutes les parties de la fleur bien conservées et en place, j'ai dû inelure tous mes échantillons floraux dans la paraffine. Je ne décrirai pas les méthodes d’inclusion si répandues actuellement ; cependant je dois mentionner un perfectionnement que j'ai fait subir à ces méthodes en introduisant l'emploi de l'alcool butylique normal qui rend maintenant. de précieux services pour les inclusions de pièces anatomiques délicates (1).

Les principaux inconvénients des méthodes ordinaires sont : l’impureté des produits employés, les traces d’eau que contient presque toujours l'alcool éthylique du commerce dit absolu, la contraction du protoplasma et le durcissement des tissus dans le xylol ou le toluène. Enfin, le prix de revient de ces produits est toujours très élevé.

J'ai cherché à supprimer ces inconvénients et à simplifier le travail de l'inclusion en réduisant le nombre des bains. Pour cela, j'ai employé l’alcool butylique normal, qui est livré dans le commerce pur et absolument anhydre. Cet alcool est un produit accessoire de la fabrication de l’acétone (procédé de Fernbach) ; actuellement, on en obtient chaque année plusieurs milliers de tonnes qui n’ont aucune application industrielle.

(1) M. LarBauD, Nouvelle technique pour les inclusions et les préparations microscopiques des tissus végétaux et animaux (Comptes Rendus de l’Académie des sciences, 23 mai 1921).

206 M. LARBAUD

Ce produit a sur l'alcool éthylique l'avantage de dissoudre la paraffine, ce qui supprime complètement le xylol ou le toluène.

L'alcool butylique normal dissolvant très peu d’eau (1/12 de son volume), on ne peut pas préparer directement, par addition d’eau, la série des alcools à 309, à 609 et à 809. Mais le mélange, en parties égales, d'alcool éthylique à 95° et d'alcool butylique normal pur est un très bon dissolvant de l'eau. J'emploie done ce mélange pour les quatre premiers bains.

Les calculs montrent qu’à 100 centimètres cubes de ce mélange il faut ajouter :

12205 d’eau pour obtenir de l’alcool à 300.

62c0,5 Le à 600.

C’est ici que s’introduit la simplification de ma méthcde. Au lieu de passer les matériaux à inclure dans deux bains d'alcool éthylique absolu, puis dans les trois bains suivants :

19 Alcool absolu : 2/3 ; xylol ou toluène : 1/3 ; 20 — LS — 2/3 :

3° Xylol ou toluène,

je remplace ces cinq bains par un seul bain d'alcool butylique normal ; puis je continue la méthode ordinaire d’inclusion en remplaçant le xylol par l'alcool butylique dans les bains intermédiaires additionnés d’une quantité de paraffine de plus en plus grande.

Dans tous les cas où J'ai employé cette méthode d'inclusion en passant par l'alcool butylique normal, j'ai observé la parfaite conservation du protoplasma sans aucune rétraction. Les colorations en masse, faites avant l'inclusion, n’ont subi aucune altération, ce qui n’est pas le cas pour la méthode ordinaire. Au moment de l'inclusion, les pièces ne sont ni dures ni cassantes comme après leur traitement par le xylol ou le toluène.

Toutes mes coupes ont été faites avec le microtome à glissière de Jung. Celam’a demandé beaucoup plus de temps, puisque j'ai dû faire les coupes une à une et les porter l’une

après l’autre sur les lames, au lieu d'opérer beaucoup plus rapidement en faisant des coupes en tænias avec le microtome de Minot plus employé. Mais j'ai remarqué que le mécanisme de ce dernier est très défavorable à un travail un peu délicat ; c'est le bloc de paraffine qui se déplace et qui vient heurter chaque fois le rasoir; cela produit très souvent un tassement de la coupe dans le sens du déplacement du bloc. Au contraire, avec le microtome à glissière, c’est le rasoir quise déplace, et le bloc d’inclusion reste fixe ; en outre, il est bien plus facile avec cet instrument de surveiller les coupes, et on est sûr de n'en manquer aucune, tandis qu'avec le Minot, pour amorcer le tænia, on perd souvent des parties très intéressantes à étudier. Enfin, avec le micotome à glissière, les coupes ne sont Jamais déformées.

Pour les petites fleurs comme les Galium, j'ai monté toutes les coupes ainsi chtenues.

Pour des fleurs de taille plus grande,comme les Geranium, j'ai pris une coupe sur cinq ou sur six ; enfin, pour les plus grosses fleurs, comme le Zilium Martagon, je n’ai gardé qu’une coupe sur dix. Toutefois, J'ai toujours pris davantage de coupes vers la base de la fleur, région où se trouvent rassemblées, sur une très petite hauteur, des parties très différentes et intéressantes à étudier: séparation des diverses pièces florales, nectaires, etc.

En général, j'ai monté trois séries de lames en même temps : sur la première, je portais parmi les coupes conservées celles de rang 1, 4, 7, 10, etc..; sur la deuxième, les coupes 2, 5, 8, 11, etc, et sur la troisième les coupes 3, 6, 9, 12, etc.

Chacune de ces séries a été colorée différemment. Voici les trois groupes de colorants que j'ai employés :

19 Vésuvine (brun Bismarck) et Vert lumière;

2° Fuchsine de Ziehl et Vert lumière ;

30 Hématoxyline de Heidenhain et Vert lumière ;

Grâce à ces trois différentes colorations, J'ai pu souvent faive des différenciations qui ne m’auralent pas été données par une seule coloration.

Les observations de ces coupes ont été faites avec deux inicroscopes munis des mêmes systèmes optiques: surla platine

de l’un, je plaçais la préparation de l'échantillon de plaine et, sur celle de l’autre, la préparation de montagne. Je pouvais ainsi observer très facilement et apprécier avec exactitude les différences anatomiques causées par l'altitude.

Mes coupes ont été faites transversalement et longitudi- nalement, ce qui était indispensable pour bien juger la dimension des différentes pièces florales en longueur et en épaisseur.

Quelques-uns des dessins reproduits dans ce mémoire ont été faits à la chambre claire, mais le plus grand nombre ont étépris sur des photographies microscopiques ou quelquefois dessinées directement sur une projection photographique sans passer par l'intermédiaire de la reproduction photographique sur papier ou sur plaque.

Les figures placées dans le texte montrent les différences anatomiques observées. Celles qui portent la lettre P indiquent les échantillons de plaine et celles qui portent la lettre M les échantillons de montagne.

Pour avoir des renseignements précis sur la morphologie et sur les modifications causées par l'altitude, j'ai effectué, au cours de mes herborisations, en montagne et en plaine, des mensurations et des numérations pour les différents organes de la plante, et,en particulier pour les fleurs, j'ai voulu compléter ces notes par les mêmes mesures sur les échantillons de l’'Herbier de la Flore de France du Muséum.

J'ai fait ce travail pour les quatre plantes de la famille des Renonculacées étudiées dans ce mémoire. Pour chacune d'elles, j'ai mesuré la hauteur de la tige principale, la longueur, la largeur moyenne et le nombre des feuilles, la longueur du pétiole, le nombre des fleurs, les dimersions des sépales, des pétales, du pédoncule. Voici les résultats que j'ai

obtenus en classant les localités par ordre d’altitude croissante :