TR EN ROC RLE CP
aus ML Er es din PAU E re RPONONAE MRC TN ee TR OU CS MERE OS VE Mae « 3 v sx u MT F
B. Autre technique : placer la culture entre lame et lamelle, comme ci-dessus. Porter sur la lame, au contact d’un bord de la lamelle, une trace de solution colorante {moins diluée que dans le cas précédent).
Examiner. ;
Dans les deux cas, le mélange doit être presque incolore à l’œil nu. Au microscope, les microbes apparaissent colorés sur fond clair.
Le procédé est délicat et ne réussit pas pour tous les microbes.
La très grande généralité des microbes peuvent et doivent être étudiés à l’aide de deux méthodes :
1° Coloration simple ;
20 Coloration par la méthode de Gram.
Dans certains cas, il faut avoir recours à des méthodes spéciales.
La coloration des capsules, des spores et des cils demande également des méthodes particulières.
Outillage nécessaire. — Il faut avoir à portée de la main :
Les solutions colorantes, en flacons compte-gouttes ;
Divers réactirs (alcool absolu, alcooléther, solution iodo-iodurée, etc.) ;
Huile de cèdre;
Lames et lamelles, propres;
Pipettes et fils de platine;
Pissette à eau (fig. 131); Fig. 131: — Pissette à eau.
Cristailisoir, pour les liquides de lavage ;
Compresses, papier-filtre ;.
Une flamme chauffante, d'ordinaire bec Bunsen à veilleuse.
Coloration simple.
Choix du colorant. — Pour les colorations simples, on a presque toujours intérêt à colorer par la thionine phéniquée, qui est le colorant microbien le plus électif. A défaut, on peut employer le bleu de toluidine ou le bleu de méthylène ur
Ces colorants, qui sont très électifs et qui ne surcolorent pas, sont indispensables pour les frottis, où les microbes sont mélangés aux éléments cellulaires et aux débris de tissus.
il à: el T1
RER GE 0e RP OT PTE EL CN AT D I OP UNE 2 + 5 in A » LT PAS 2, DRE
Exceptionnellement, pour des microbes difficiles à colorer, il est … préférable d'employer la fuchsine phéniquée, diluée au 10° dans l’eau. ; Coloration des microbes en cultures. — 1° Méthode directe. — La méthode directe est applicable avec tous les colorants et à tous les microbes. : |
a. Étalement. — A l’aide du fil de platine, porter sur une lame une anse de culture en milieu liquide, ou une émulsion de culture sur milieu solide, comme il a été indiqué ci-dessus (p. 233). Étaler en couche mince, régulière.
b. Dessiccation. — Sécher. Pour hâter la dessiccation, chauffer « légèrement à quelque distance au-dessus de la veilleuse; pour éviter la formation de cercles concentriques, agiter constamment le liquide avec le fil de platine jusqu'à dessicca- Üon.
Pendant cette opération, chauffer avec prudence pour ne pas déformer les microbes : la température de la lame doit demeurer supportable au contact de la face dorsale des doigts.
On peut également sécher sur la platine chauffante (lig. 132).
c. Fivation. — «x. Habiluellement on fixe par la chaleur. .
La lame étant tenue par une extrémité, la passer trois fois dans la flamme, face enduite en haut, à vitesse modérée, « comme en coupant du pain ». À
Ce temps, sans être délicat, demande un peu d'habitude.
me
‘ig. 132. — Platine chauffante,
Fig. 133. — Pince de Debrandt.
Pour cette opération et pour les suivantes, on s’exercera à tenir les lames à la main. Sinon on ulilisera la pince de Debrandt (fig. 133).
6. On peut fixer par l'alcool éther : parties égales d’alcool absolu et d'éther rectifié. Faire tomber sur la préparation quelques gouttes d’alcool-éther ; laisser évaporer.
d. Coloration. — Verser sur la préparation la quantité de thionine phéniquée nécessaire pour couvrir complètement ; laisser agir une demi-minute à une minute. Égoutter le colorant.
Laver rapidement à l’eau avec la pissette.
Sécher. Éponger l'excès d’eau entre deux feuilles de papier-filtre. Compléter la dessiccation comme au temps b
e. Exumen.— Mettre sur la préparation une goutte d'huile de cèdre. Examiner avec l’objec.if à immersion.
Si la préparation doit être conservée, éliqueter. Enlever l'huile de cèdre en lavant au xylol. Conserver dans une boîte à préparations, à l’abri des poussières.
A la longue, les préparations à la thionine se décolorent plus ou moins. la fuchsine tient mieux.
20 Méthode régressive. — La méthode régressive est applicable exclusivement avec la thionine; elle donne des préparations très claires.
a à d. Comme ci-dessus.
e. Faire agir rapidement l'alcool absolu. Laver à l’eau, etc.
Coloration des microbes sur frottis. — La méthode régressive est presque toujours préférable. |
a. Étalement. — Pour les pulpes d'organes (foie, rate, etc.) : disposer un fragment d’organe sur une lame : avec une autre lame, écraser et étaler. Pour les produits pathologiques, voir Analyse du pus, du
sang, etc. ; b. Dessiccation : Comme ci-dessus. c. Fixation. — Vixer de préférence par l’alcool-éther ou l’alcool
absolu, en ayant soin de s'assurer si ce dernier est réellement absolu (Voy. p. 250). La chaleur, altérant beaucoup les éléments cellulaires, est ici inférieure aux fixateurs précédents.
d. Coluration : comme ci-dessus. Laisser agir la thionine une à deux minutes, suivant l'épaisseur du frottis.
e. Faire agir rapidement l'alcool.
f. Laver à l’eau, sécher, examiner.
Variantes. — 10 On peut examiner sous l’eau, entre lame et lamelle, ce qui permet parfois de mieux saisir certains détails de morphologie.
Opérer comme ci-dessus, a à d; à la fin du temps d, laisser sur la préparation une goutte d’eau.
e. Poser sur- la goutte d’eau une lamelle, enlever soigneusement l'excès d’eau qui peut déborder de la lamelle (avec du papier-filtre).
f. Mettre sur la lamelle de l'huile de cèdre. Examiner à l'immersion.
2° Certains auteurs, de plus en plus rares, préfèrent colorer sur lamelle. Le procédé est plus délicat et sans avantage.
Saisir la lamelle avec une pince Cornet ou une pince Debrandt. Opérer ensuite comme ci-dessus. Au temps e, déposer sur une lame une goutte de baume du Canada ; renverser la lamelle sur le baume; appuyer légèrement. Déposer une goutte d'huile de cèdre sur la lamelle, examiner
Coloration par la méthode de Gram.
Indications. — Employée dans un but de diagnostic, elle doit être appliquée invariablement à tout microbe dont on fait l'étude.
‘Principe. — L'action successive des dérivés basiques de la pararosaniline (on emploie généralement le violet phéniqué) et de la solution iodo-iodurée détermine la formation d'un composé iodé, qui se fixe très énergiquement sur certaines bactéries et ne se fixe pas sur d’autres bactéries, ni sur les tissus. Un lavage ultérieur par un dissolvant approprié ne décolore pas les premières, alors qu’il décolore les seconds.
Coloration des microbesen culture.— Procédé de choix.— a à c, comme pour la coloration simple.
d. Verser sur la préparation la quantité de violet Pre (violet de gentiane ou kristall-violet) nécessaire pour ‘couvrir complètement ; laisser agir trente secondes.
e. Égoutter le colorant. Sans laver, verser ‘quelques gouttes de solution iodo-iodurée forte. Laisser dix à douze secondes. Égoutter la solution, renverser une nouvelle quantité, laisser le même temps.
Solution iodo-iodurée forte (Nicolle) :
LOUE da den ne et CR CN ae APN CE 1 gramme.
lodure depotassiumi#7 7010082 2 grammes.
Hausse RME Re CE 200 —
Dissoudre l'iodure de potassium dans quelques centimètres cubes d’eau ; ajouter l’iode, dissoudre; ajouter peu à peu le reste de l’eau.
f. Égoutter. Sans laver, en inclinant légèrement la lame, verser goutte à goutte la solution suivante (M. Nicolle) :
Aleool absolue ee RE 5 parties.
ACÉLORE., 0 ARS TR RER 1 partie.
La solution se colore en violet ; continuer le lavage pendant quelques secondes, jusqu’à ce qu’elle passe incolore.
Ce dernier temps, décoloration, est le seul un peu délicat. IL demande un peu d'habitude.
.. g. A ce moment, lu réaction de Gram est terminée. IL est presque toujours indiqué de recolorer.
Dans ce but, on fait agir PAnsant cinq à huit secondes Ia solu-
tion suivante :
Liquide de Ziehl......... SR RER RE Te À partie. PRE TIME CRETE PURE MADERTEE 100 parties.
h. Laver. Sécher. Examiner.
Remarques. — Le temps g n’est pas indispensable quand on est sûr d’avoir affaire à une culture pure
En tout autre cas, la recoloration doit être pratiquée.
On peut substituer à la fuchsine un autre colorant de fond, faisant contraste avec le violet (éosine aqueuse, safranine, etc.).
La durée indiquée pour chacun des temps est une moyenne. Certains microbes (Staphylocoque) se colorent et fixent très vite; d'autres (Bacille de Lœffler) plus lentement. Une erreur assez commune chez les débutants consiste à vouloir opérer trop vite, ce qui peut fausser les résultats.
Certains microbes, difficilement colorables, prennent le Gram à condition de prolonger l’action des réactifs (Voy. Méthode de Much).
Résultats. — Après application de la fechnique ci-dessus, certains microbes restent colorés en violet foncé: on dit qu'ils prennent le Gram, qu'ils restent colorés par la méthode de Gran.
D'autres microbes ne gardent pas la couleur violet foncé ; si on a pratiqué la recoloration (temps g), ils sont colorés en rouge. On dit qu'ils ne prennent pas le Gram, qu'ils se décolorent par la méthode
de Gram.
Prennent le Gram :
Staphylocoque. Pneumocoque. Vibrion septique. Streptocoque. Bacille diphtérique. Bacille du tétanos. Entérocoque. Bactéridie charbonneuse. Etc. es
Ne prennent pas le Gram:
Gonocoque. Bacilles paratyphiques. Bacille dysentérique. Méningocoque. Colibacille. Vibrion cholérique. Bacille typhique. Bacille de la peste. Etc.
- Variante. — 1. La méthode primitive de Gram comportait une
coloration par le violet aniliné pendant cinq minutes; puis action de la solution de Lugol :
No ie da y ele DAT due 1 gramme.
ROOUFO AM DOTISSQUMe 2,52... 2 grammes.
PAU Me tee et SARETSE ESA AIR 300 cent. cubes.
Enfin décoloration par l'alcool.
DopTer et SACQUÉPÉE. — Baclériologie, 2 édit. 16
Fr D TER NN RE AID MONT ENT ; 27 ME Ld LR d'a A,
Coloration des microbes sur frottis. — Dans les frottis, les
microbes se trouvent généralement englobés dans une substance
albuminoïde qui met obstacle à l’action des réactifs; aussi faut-il laisser agir ces derniers un peu plus longtemps. | De plus, ilest toujours indispensable de recolorerle fond de la prépa-
ration parune couleurfaisant contraste, tant pour apprécier les rap- -
ports des microbes avec les cellules que pour permettre de déceler à la foisles microbes qui prennent le Gram et ceux quinele prennent pas.
Technique. — a, b, c. Comme ci-dessus.
d: Faire agir le violet phéniqué quarante secondes.
e. Égoutter le colorant. Sans laver, verser quelques gouttes de solution iodo-iodurée forte. Laisser quinze secondes. Égoutter, reverser de la solution; laisser à nouveau quinze secondes.
f. Egoutter. Sans laver, décolorer par l’alcool-acétone, en versant goutte à goutte jusqu’à ce que ce dernier passe incolore.
Le fond de la préparation ne doit pas garder une teinte violacée.
g. Comme dans l'opération précédente. :
Méthode de Claudius. — Les agents de différenciation et de décoloration ne sont pas les mêmes que pour la méthode de Gram, mais les résultats obtenus sont identiques, et la technique n'est pas simplifiée; aussi la méthode de Claudius n’a-t-elle pas détrôné celle de Gram.
a. Colorer au violet de méthyle (solution aqueuse à 1 p. 100), une minute.
b. Laver à l’eau, étancher au papier-filtre; faire agir une minute là solution picriquée :
Acide picrique (solution saturée)............. ‘1 partie. Eau distillée..,... RS TT SET LICE 1 —
c. Sécher au papier-filtre. Porter dans un vase clos renfermant du chloroforme ; laisser tant que la décoloration se poursuit. d. Sécher, monter au baume du Canada.
Méthodes spéciales. Ê
Coloration des bacilles acido-résistants. — Méthode d'Ehrlich. — Certains microbes, bacilles de la lèpre, de la tuberculose, etc., se colorent difficilement par les couleurs d'aniline; mais une fois colorés, ils retiennent énergiquement la couleur.
C'est sur ce principe général, posé par Ehrlich, qu'est basée la
coloration élective de ces microbes. On colore très fortement (à
chaud, ou pendant longtemps) à l’aide d'une couleur basique : liquide de Ziehl, violet phéniqué, etc. ; on décolore ensuite avec un agent énergique : acide sulfurique ou azotique dilués, acides or-
ones: es vds fi ji CÉEe a 4 ch “ .
fe ER
ganiques, chlorhydrate d’aniline, etc. Dans ces conditions, seuls
restent colorés les Bacilles dits acido-résistants.
Les détails de la méthode seront exposés plus loin.
Coloration par l’éosine-bleu. — Romanowsky a montré qu'en mélangeant en proportions déterminées des solutions d’éosine (à l'eau) et de bleu de méthylène, on obtient un colorant réellement nouveau : le mélange présente les affinités tinctoriales de l’éosine d'une part, du bleu d'autre part, et il colore en outre d’une teinte particulière, gris bleuté, certains éléments parasitaires (QE autres lhématozoaire du paludisme).
Les détails de la méthode, telle qu’elle est appliquée actuellement (procédés de Laveran, de Giemsa, etc.) seront exposés plus loin.
Coloration des capsules.
Divers microbes, Pneumocoque, Pneumobacille, sont entourés
- d'une zone claire, réfringente, ou capsule.
La capsule est visible à l’état frais, sans coloration.
Un peu réfractaire aux colorants, elle est mise en évidence par application des procédés habituels de coloration, quand le fond de la préparation est albumineux (milieux albumineux, frottis); la capsule apparaît alors incolore {capsules négatives) sur un fond coloré.
On peut, d’autre part, colorer les capsules par divers procédés.
19 Procédé de choix. — Préparer les lames comme d'ordinaire.
a. Colorer par la fuchsine phéniquée, une à deux minutes; laver.
b. Porter vingt à quarante secondes dans une solution d'acide acétique à 1 p. 100.
c. Laver, sécher ; huile de cèdre.
Les microbes sont rouge vif ; les capsules, rosées.
20 On peut se contenter (Nicolle et Remlinger) de colorer par le violet phéniqué pendant quatre à six secondes et de faire agir ensuite rapidement l’alcool-acétone au tiers. — Microbes, violet foncé ; capsules, violet pâle.
3° Procédé de Ribbert. — On incorpore à la solution colorante un agent de décoloration (acide acétique) :
AG NN CT RSR RER ER Hoi ee 100 parties.
PRADA AGR RICO, 2 8 coeue nadia veto de.0 1
DR DOM Teen an use demo due duree de 50
DOS TARN ER SEA CEUX ete tri …. À saturation, à chaud.
- Colorer rapidement-(quelques secondes).
4° Pour les microbes capsulés prenant le Gram, on peut utiliser l'un des procédés suivants :
Procédé de Rosenow. — 1° Plonger la lame dans une solution de tanin de 5 p. 100, dix à vingt secondes.
20 Laver, colorer au violet de gentiane, à chaud, une minute.
2 Laver, faire agir le liquide de Gram, trente secondes.
49 Décolorer par l'alcool à 95°. .
59 Recolorer par l’éosine en solution alcoolique saturée, laver.
Le Pneumocoque est brun sombre ; la capsule, rouge.
Procédé de Wadsworth. — Analogue au précédent. . Fixer au formol, deux à cinq minutes. Colorer deux minutes au violet aniliné (voy. plus loin). Traiter deux minutes par le liquide de Gram. Décolorer par l’alcool à 95°. Recolorer par la fuchsine en solution aqueuse.
Coloration des spores.
Les spores, très réfringentes, sont visibles sans coloration.
Sur les préparations colorées par les méthodes courantes, elles demeurent incolores et tranchent sur les corps microbiens, colorés.
Elles sont difficiles à colorer; mais, une fois colorées, elles résistent fortement à la décoloration. Comme la difficulté de coloration est due à la résistance de la membrane d’enveloppe, on doit forcer au préalable cette dernière par un artifice quelconque ; on emploie, dans ce but, la chaleur ou les agents chimiques.
La résistance aux agents décolorants permet d'obtenir une double coloration. Il faut toujours avoir recours à cette dernière, qui met en évidence les caractères nécessaires pour différencier les spores des formes d’involution ou de dégénérescence.
Les procédés de décoloration employés sont les mêmes que pour les bacilles acido-résistants.
Procédé de Moœæller. — Procédé de choix.
a. Préparer les lames comme d'habitude; fixer à l'alcool absolu.
b. Plonger pendant cinq minutes dans une solution aqueuse d'acide chromique à 5 p. 100. Laver.
c. Colorer à la fuchsine phéniquée, soit à chaud, pendant cinq à dix minutes vers 60° ; soit à froid, pendant cinq heures.
d. Décolorer par l’aniline chlorhydrique à 2 p. 100 (Voy. plus us ’ compléter la décoloration par l'alcool absolu, laver ;
e. Recolorer par le Kühne dilué à 1 p. 3. |
Les spores sont rouges; les corps bactériens sont bleus.
Variantes.—1° Au temps d, on peut sans inconvénient employer comme décolorant soit l'acide sulfurique à 4 ou 5 p.100 (formule
DT
COLORATION À L'ÉTAT SEC SUR LAMES. 245 primitive du procédé Mæller}, soit l'acide nitrique à 10 ou 20 p. 100. L'alcool absolu suffit pour quelques espèces.
29 On peut substituer à l'acide chromique (temps 6) d’autres agents chimiques. Pour toutes les méthodes suivantes, les autres temps comme Cidessus, sauf indication contraire.
Procédé d’Aryesky. — Acide chlorhydrique à 0,5 p. 100, à chaud.
Procédé de Thesing. — Chlorure de platine à 4 p. 100, à chaud.
Procédé d’Orszag :
Salicylate de soude, solulion à 0,5 p. 100.... 4 parties. Acide acétique, solution à 5 p. 100.......... 1 partie.
Placer une goutte du mélange sur la lame; y ajouter la culture, délayer, sécher, fixer, Le reste comme plus haut.
30 L'action de la chaleur suffit à rendre les spores colorables : traiter par la chaleur humide (autoclave) à 120° pendant une heure (Buchner) ; ou, plus simplement, par la chaleur sèche, en passant dix fois de suite dans la flamme de Bunsen (Hüeppe}). Colorer ensuite au violet.
La chaleur, poussée à ce degré, altère sensiblement les corps microbiens, qui se colorent moins que les spores. Le procédé est défectueux.
Coloration des cils.
Les cils de certaines grosses bactéries (sulfo-bactéries) sont visibles à l'examen direct. Au contraire, les cils des espèces pathogènes ne sont visibles qu'après coloration. Ceux du Vibrion cholérique et de quelques espèces voisines peuvent être teintés par une méthode simple ; dans tous les autres cas, il faut s'adresser à des méthodes spéciales.
Méthode simple. — Procédé de Strauss. — Le procédé de Strauss est applicable exclusivement aux vibrions : Vibrion cholérique, Vibrio Melchnikovi, Vibrion de Finkler et Prior. Il ne réussit pas à colorer les cils d’autres espèces, Colibacille, Bacille typhique, etc.
Porter sur lame une goutte de culture jeune en bouillon. Ajouter une goutte de fuchsine phéniquée, diluée au cinquième; mélanger. Couvrir d’une lamelle. Examiner à l'immersion.
Quand la préparation est réussie, on voit les cils faiblement teintés en rose.
Méthodes spéciales. — Sauf le cas précédent, les cils ne peuvent être colorés qu'après mordançage énergique, toutes les substances organiques de la préparation se colorent en mème temps. Aussi faut-il éliminer autant que possible tout ce qui n est pas le corps microbien.
Il est prudent d'opérer comme suit :
19 Prélever la surface de cultures jeunes (douze heures au plus) sur ë gélose, sans entamer le milieu; diluer dans l’eau de conduite filtrée, en s quantité telle que l’émulsion soit à peine opalescente.
20 Si l’on a le temps, il vaut mieux émulsionnerla culture dans le formol à 3 ou 4 p. 100; laisser les microbes se déposer au fond ; décanter, émulsionner le dépôt dans le formol à 1 p. 100; laisser déposer, émulsionner le dépôt dans l’eau de conduite, étaler sur lames.
30 On peut saisir la lame à l’un des angles (toujours le même) de l’extrémité libre, ou se servir d’une pince Debrandit : en tous cas, la maintenir inclinée, de manière que les réactifs ne puissent baigner les doigts ou la pince. Éviter surtout que les réactifs ne viennent lécher les doigts (riches en matière organique).
40 Employer des lames d’une rigoureuse propreté ; au besoin, laver à l'acide chlorhydrique, puis rincer à l’eau distillée fraîche; conserver dans l'alcool ou l'alcool-éther. Au dernier moment, il est bon de les passer une vingtaine de fois dans la partie la plus chauffante du bec Bunsen, Laisser refroidir complètement.
5o Répartir sur la lame des gouttelettes extrémement fines del’ émulsion, . bien séparées ; laisser sécher à la température ambiante, à l'abri des poussières. Si la lame est bien propre, les gouttelettes s’étalent régulièrement.
La fixation peut altérer un peu les cils. On peut ne pas fixer, mais il faudra alors être prudent dans les manipulations ultérieures : les lavages seront effectués très légèrement.
Procédé de Van Ermengem. — Ce procédé donne des résultats réguliers. 11 est basé sur la réduction du nitrate d'argent fixé au préalable sur les ciis. |
a. Plonger la lame pendant trente minutes à froid ou cinq minues à 600 dans le bain fixateur :
Acide osmique à 2 p. 100......... 33 centimètres cubes. Tantn 4320 2p 4100 PRES 66:28 —.
Ad ACÉUERTS TE PAT IV ou V gouttes.
b. Laver soigneusement à l’eau distillée, puis à l’alcool.
c. Faire agir pendant quinze à trente secondes le sensibilisateur : solution de nitrate d'argent à 0,5 ou 1 p. 100.
d. Sans laver, plonger une à deux minutes dans le bain réducteur :
Acide D'ALITMUE. Se MP EE RATES 5 grammes.
TUNER RTS PANNE PRE 3 —
Acétate de soude fondu......... 10 =
Eau distiliéer ss mere 350 centimètres cubes.
e. Plonger dans le bain de nitrate d'argent, use ’à ce que le bain noircisse.
f. Laver, sécher, examiner.
Si la coloration n’est pas suffisante, traiter à nouveau d’abord par le réducteur, puis par le sensibilisateur. 4
Variantes. — Procédé de Stephens.—{dentique au Van Ermengem, sauf substitution au nitrate d'argent de la largine à 2 p. 100.
Procédé de Zettnov. — Procédé recommandé. — Ce procédé, assez long, donne de très belles préparations.
A. Mordant. — Il faut dissoudre :
I. { gramme de tartre stibié dans 15 centimètres cubes d’eau.
