CHAPITRE II

STÉRILISATION

Le grand principe énoncé par Pasteur, et qui domine toute la bactériologie, consiste dans Yisolement des microbes à étudier. Il faut obtenir des cultures pures de chaque microbe, pour pouvoir en définir les caractères morphologiques et biologiques et les effets pathogènes. Or, Pair, l’eau contiennent des microbes divers ; tous les objets, nos mains, même propres en apparence, sont recouverts de poussières microbiennes. V asepsie, ne suffira donc pas pour obtenir des cultures pures ; il faudra faire une antisepsie rigoureuse. Les récipients, les milieux de culture qu’on ne peut recueillir aseptiquement, (bouillons, gélatine, gélose, etc.), les instruments, etc., devront être stérilisés avec le plus grand soin. L’étude des méthodes de stérilisation et du maniement des appareils stérilisateurs est donc indispensable à tout bactériologiste.

La stérilisation peut s’obtenir par différents procédés ,

§ 1. — Stérilisation par la chaleur

La chaleur est le plus sûr des agents de stérilisation. Aucun être vivant ne peut résister à une température suffisamment élevée. La plupart des microbes sont tués en quelques minutes par un chauffage à une température inférieure à + 100°; néanmoins, certaines spores nécessitent, pour être détruites, une chaleur supérieure à -f- 100°. Certains milieux, couramment employés, ne peuvent supporter assez longtemps une température de + 100° sans s’altérer profondément; la gélatine, ayant

été soumise à une ébullition prolongée, ne se reprend plus en masse. D’autres milieux, tWs que le sérum, ne peuvent même être chauffés à 70° sans se modifier. On doit, dans ces cas, avoir recours à un artifice (chauffage discontinu).

A) — Chauffage continu a -f- 100° ou au-dessus

La stérilisation s’opère, en une seule séance, à -f- 100° ou audessus, si les objets ou milieux à chauffer ne s’altèrent pas à cette température, maintenue pendant un temps suffisant.

La chaleur peut être employée sèche ou humide.

1° Stérilisation par la chaleur sèche.

— A. Flambage. — Le procédé le plus courant est le flambage. On promène rapidement, trois ou quatre fois de suite, l’objet à stériliser dans l’extrémité supérieure de la flamme d’une lampe à alcool ou d’un bec Bunsen à flamme chauffante, bleue l. Cette méthode est applicable aux instruments métalliques même tranchants, aux pipettes en verre, au coton qui bouche les tubes ou ballons, aux orifices des récipients qu’on est obligé de déboucher. Les instruments sont stérilisés avant que la chaleur les détrempe, les bistouris peuvent donc conserver leur tranchant après un flambage rapide mais suffisant. On peut, aussi flamber les tampons de coton un peu serrés, les capuchons de papier sans les enflammer. On aura toujours soin de laisser les objets se refroidir avant de les employer, sous peine, de voir se briser les objets en verre, et de ne pas pouvoir effectuer un prélèvement par coagulation des humeurs dans l’ouverture du récipient (partie effilée de la pipette) ou de stériliser les produits prélevés.

Fig. 29.

Bec Bunsen à veilleuse.

1 Dans le brûleur Wiesnegg les mouvements de la virole sont solidaires de ceux du robinet, à gaz. Il existe des becs à veilleuse (fig. 29) qui se rallument d’eux-mêmes.

STÉRILISATION

Le bec Bunsen muni d’un long tube de caoutchouc servira à stériliser de haut en bas les goulots des flacons remplis dé culture, qu’on ne voudra ou qu’on ne pourra pas pencher. En un mot, un bec Bunsen ou à défaut une lampe à alcool, devront toujours être allumés à côté de l’expérimentateur qui examine, transplante ou inocule des cultures, qui fait une autopsie, etc.

B. Chauffage au rouge. — On peut porter au rouge, les fils de platine (voir p. 21). On attendra le refroidissement avant de s’en servir, surtout si le fil de platine est un peu gros. On peut également chauffer au rouge sur un bec Bunsen les bougies de porcelaine (voir p. 52), qu’on désire « régénérer » après une filtration.

C. Stérilisation par l’air chaud. — On peut facilement porter à -f- 150° l’air d’un récipient métallique. Les appareils à air chaud servent à stériliser les objets en verre, la ouate, le papier, les instruments métalliques. Un séjour de vingt minutes à une heure suffit pour tuer tous les germes. Les récipients en verre seront bouchés avec un tampon de coton ou de papier (voy. p. 22). Les objets de verrerie tels que verres de montre, boîtes de Pétri, etc., seront enveloppés dans du papier pour pouvoir être retirés de' l’appareil sans se contaminer au contact de l’air. La ouate à conserver stérile sera déposée dans un flacon à large ouverture, celle-ci bouchée par un tampon d’ouate. Les instruments métalliques pourront être enveloppés de papier. Tous les objets de verrerie devront être soigneusement séchés pour éviter la possibilité du bris (voir Y Étuve à sécher de Wiesnegg, p. 28).

La ouate non hydrophile et le papier blanc changent de coloration de -f- 140° à 150° ; ils deviennent jaune clair ; cette teinte sera donc l’indice d’une bonne stérilisation. Un tampon resté blanc n’a pas été porté à + 140° ; un tampon trop roussi indique une température supérieure à -}- 150°. U y a inconvénient à trop roussir les tampons de ouate qui perdent leur homogénéité et laissent échapper des produits empyreumatiques dans les flacons. Ces produits sont antiseptiques et font aux récipients des taches très difficiles à enlever. Un objet ainsi souillé est

devenu inutilisable. On pourra donc se servir d’un morceau de ouate pour apprécier la stérilisation d’objets ne comportant pas de tampons; on éteindra le gaz lorsque le morceau de ouate sera devenu jaune clair. La température de tous les appareils stérilisateurs à air chaud n’est pas la même dans toute la

Four Pasteur.

chambre à air, elle est beaucoup plus élevée vers le bas et le long des bords ; on mettra donc la verrerie au fond et la ouate par-dessus : les tubes de verre bouchés au coton ou au papier seront placés verticalement , l’orifice en haut.

Le stérilisateur à air chaud le plus usité est le Four Pasteur. Il est bien entendu que son emploi ne peut s’appliquer qu’aux objets secs ; aucun liquide, aucune substance évaporable ne doit y être introduite.

STERILISATION

Le four Pasteur (fig. 30) consiste essentiellement en un cylindre de tôle, à double paroi. Une Cheminée latérale sert au dégagement des gaz de la combustion. Un couvercle en tôle, muni d’un bouton, ferme l’ouverture supérieure. Ce couvercle est percé d’un orifice pour le passage du thermomètre qui sera fixé par un bouchon en liège dans lequel il glissera à frottement. La chaleur est fournie par une couronne à gaz placée sous le fond. Un panier en toile métallique, exactement de la dimension du fond, muni d’une anse, contiendra les objets à stériliser. Le tout en place (comme il a été dit plus haut), on allume le gaz (en ayant soin de présenter l’allumette enflammée avant d’ouvrir le robinet à gaz, pour éviter la formation d’un mélange détonant), et on laisse monter la température à + 150° ou -j- 160°. On règle alors par tâtonnement. Une demi-heure de chauffage à -j- 150° suffit en général à stériliser les objets contenus dans le four Pasteur. En pratique, on se sert rarement du thermomètre : on ouvre le gaz à plein canal et on soulève de temps à autre le couvercle pour juger de la couleur de la ouate. On éteint dès que celle-ci commence à prendre la teinte jaune café au lait, en se rappelant que la chaleur est toujours plus intense au fond et le long des bords qu’au milieu du panier. Il faudra laisser refroidir la verrerie dans le four même : 1° pour éviter un brusque changement de température capable de briser les objets en verre ; 2° pour que le rayonnement des parois, continuant pendant un certain temps, complète la stérilisation et roussisse la ouate du centre du panier.

On peut construire soi-même une étuve à air chaud et sans grand, frais. L’étuve de Salomonsen (fig. 31) se compose d’une boîte à biscuits métallique (24 centimètres de hauteur, 22 centimètres de largeur, 21 centimètres de profondeur). Le couvercle est percé d’un orifice pour laisser passer un thermomètre gradué jusqu’à + 200°. Plusieurs petits trous pratiqués dans les parois latérales .près du fond et près du couvercle assurent la ventilation. Dans la boîte, on dispose une feuille de grillage en fer galvanisé, carrée, et dont les côtés sont repliés en dessous, de façon à former une sorte de banc distant du fond de 2 centimètres, pour que les objets à stériliser ne puissent

toucherau fond. La boîte est recouverte de feutre, substance mauvaise conductrice de la chaleur, fixée par des tours de fil de fer. Le quart inférieur des parois latérales et la paroi inférieure sont libres de feutFe pour éviter tout danger d’incendie. Les orifices à ventilation sont ménagés à la partie supérieure des parois latérales. On place la boîte sur un trépied en fer et on chauffe au gaz. Une lame de fer-blanc interposée empêche que le fond de

Fig. 31.

Stérilisateur à air chaud de Salomonsen.

la boîte soit détérioré par la flamme. Un petit fourneau à pétrole pourrait remplacer le gaz. On manie cette étuve comme le four Pasteur.

2° Stérilisation par la chaleur humide. — Le chauffage se fait dans un liquide ou dans la vapeur d’eau.

A. Stérilisation dans l’eau bouillante ou dans l'huile. — On peut stériliser des instruments métalliques, des seringues, des objets de verrerie, en les maint enant dans un bain d’eau bouillante.

STERILISATION

On préférera un bain d’huile pour les instruments métalliques. Ce mode de stérilisation, quoique très parfait, a l’inconvénient de fournir des objets mouillés et se souillant au contact de l’air, au moment où on les retire du bain. La stérilisation par l’eau ou l’huile sera continuellement employée par le bactériologiste pour un autre but : la stérilisation des cultures qu’on abandonne, des pipettes ayant servi à ensemencer, des instruments après l’autopsie, en un mot de tous les objets contaminés par des microbes pathogènes, qu’on ne doit pas abandonner au hasard dans un laboratoire. Une grande marmite émaillée sera donc toujours prête à les recevoir, et sera tous les soirs remplie d’eau portée à l’ébullition pendant une heure. On pourrait également stériliser ainsi de petits animaux morts d’affections contagieuses, en l’absence d’un four crématoire. Un récipient de 45 centimètres de hauteur sur 35 centimètres de diamètre, muni d’un couvercle à manette et de deux fortes manettes latérales suffit à tous ces usages.

On peut obtenir des températures supérieures à -h 1 00° avec des bains d’huile ou avec des solutions salines (carbonate ou borate de sodium) L

B. Stérilisation par la vapeur sans pression. — C’eit le procédé de Koch. Les objets sont ainsi maintenus à + 99° ou -f 1 00° (suivant l’altitude) dans la vapeur d’eau. Or, à température égale, la vapeur stérilise plus rapidement que l’air et la chaleur humide pénètre plus complètement les objets que la chaleur sèche. Ce mode de stérilisation est surtout applicable aux substances liquides ou évaporables.

Le stérilisateur à vapeur de Koch consiste en un cylindre métallique. A l’intérieur du cylindre sont des rebords saillants pour soutenir deux plateaux percés de trous. Des paniers métalliques dont le fond est constitué par un grillage à larges

1 L’emploi des solutions salines pour la stérilisation par l’ébullition des seringues ou des pipettes destinées aux inoculations, aux prélèvements, aux dosages peut modifier la virulence ou la toxicité des microbes ou des toxines.

STÉRILISATION PAR LA CHALEUR HUMIDE 4i

mailles, reposent sur ces plateaux. Les objets à stériliser sont introduits dans ces paniers. L’ensemble de l’appareil sera placé sur un trépied solide.

Pour faire marcher l’appareil, on le remplit d’eau à une hauteur de 10 centimètres ; on met en place paniers, couvercle, thermomètre ; on allume le gaz jusqu’à ébullition de l’eau. La vapeur s’échappe et le thermomètre marque -f- 100°. A partir de ce moment, on laisse brûler le gaz pendant une ou trois heures, pour que la stérilisation soit complète. L’opération est longue et dispendieuse.

Les autoclaves , que nous allons décrire, peuvent fonctionner sans pression et remplacer le stérilisateur de Koch, lorsqu’on veut seulement une température de -f 100°. L’appareil de Koch n’est donc pas indispensable à un laboratoire.

C. Stérilisation par la vapeur sous pression. — Les spores de certains microbes ne sont tuées que par un chauffage à -f- 120°. Seuls les appareils stérilisant par la vapeur sous pression sont capables de les détruire ; seuls ils sont absolument sûrs ; ils sont donc indispensables au bactériologiste. La chaleur sèche ne pouvant être employée pour stériliser les milieux liquides ou susceptibles d’évaporation, on soumettra ceux-ci au chauffage à -f 120° dans les appareils à vapeur sous pression, à condition qu’ils ne s’altèrent pas à cette température (bouillon, pommes de terre, gélose, etc.). La gélatine, le sérum ne peuvent être stérilisés par ce procédé.

Tous les appareils servant à la stérilisation par la vapeur sous pression sont en définitive des marmites de Papin plus ou moins perfectionnées.

Fig. 32.

Autoclave de Chamberland.

STÉRILISATION

a. h’ autoclave de Chamberland est l’appareil le plus commode et le plus répandu (fig. 32). Il se compose d’une marmite cylindrique en cuivre (A) qu’un couvercle en bronze (B) peut fermer hermétiquement, grâce à l’interposition d’une rondelle en caoutchouc. Le couvercle est muni d’un manomètre (G) qui indique la pression et par suite la température 1, d’un robinet (D) et d’une soupape (E). Il est fixé par des bouchons mobiles (F, F') ; deux index gravés, l’un sur le couvercle, l’autre sur la marmite devant toujours être en regard l’un de l’autre. La marmite est supportée par une boîte en tôle (G) sous laquelle sont deux rampes à gaz circulaires (H et H') de diamètres différents, indépendantes l’une de l’autre. Un panier en fil de fer (I) recevra les objets à stériliser.

Pour faire fonctionner l’autoclave de Chamberland, on verse un ou deux litres d’eau dans la marmite, en a (il faut toujours une couche d’eau suffisante : 10 centimètres au moins) ; on place le panier ; on visse le couvercle. On allume la rampe à gaz (H') (approcher l’allumette enflammée avant d’ouvrir le robinet à gaz2, voir page 38) et on ouvre le robinet (D) jusqu’au moment où la vapeur s’échappe d’une façon continue. Ce robinet sert à purger l’autoclave d’air ; sans cette précaution, la température donnée, [indiquée ci-dessous d’après les tables de Régnault], calculée pour la vapeur seule, serait bien supérieure à la température réelle du mélange d’air et de vapeur de l’autoclave. Au moment où la vapeur s’échappe en jet du robinet, la température de l’autoclave atteint -}- 100°; on ferme alors le robinet (D) £t on visse la soupape (E). L’appareil entre en pression, et l’aiguille du manomètre monte. On pratique alors deux ou trois détentes de vapeur , c’est-à-dire qu’on ouvre le robinet (D) pendant quelques instants. Lorsque l’aiguille marque la pression qui correspond à la température cherchée (habituellement 1 atmosphère,; c'est-à-dire -j- 120?), on

1 0 atmosphère = 100°.

Si un des becs brûle en dedans, il faut éteindre et rallumer.

règle l’arrivée du gaz par tâtonnement (flamme de un ou deux travers de doigt) et on dévisse la soupape (E) à la limite où elle retient le jet de vapeur, d’où le réglage de la pression qui ne peut monter plus haut. On ne con^pte le temps de la stérilisation qu’à partir du moment où l’aiguille du manomètre est immobile, indiquant que la température cherchée est fixe. Le temps voulu écoulé, on éteint le gaz, et on attend que la pression soit retombée à 0 ; on ouvre seulement alors le robinet (R) 1 : Pair rentre avec un léger sifflement. On dévisse le couvercle immédiatement ; si on attendait le refroidissement, il y aurait adhérence assez difficile à vaincre entre le caoutchouc et le couvercle. Un changement toujours possible dans la pression du gaz (voir page 121 l’emploi du régulateur Moitessier), peut faire monter brusquement la pression de la vapeur d’eau et entraînerait une explosion si la soupape fonctionnait mal ; il faut donc toujours surveiller son autoclave, tant que la température n’est pas définitivement réglée.

La vapeur sous pression A -j- 115° ou -f- 120°, dans l’autoclave de Chamberland, stérilise, en vingt ou trente minutes, les milieux ou objets quelconques.

On peut l’employer sans pression, en ne fermant pas le robinet (D), et en ne vissant pas à fond les boulons du couvercle. L ' autoclave peut donc fonctionner comme V appareil de Koch, stérilisant à la vapeur à -f- 100°.

On peut même stériliser la verrerie dans l’autoclave et se passer du four Pasteur. Le seul inconvénient est que les récipients et le coton contiennent un peu d’eau condensée après le refroidissement. Il faudrait alors sécher le coton. On voit en somme que Y autoclave peut suffire, à lui seul, à toutes les stérilisations nécessaires au bactériologiste.

b. Contrôle des températures. — On peut employer des indicateurs fusibles. Un mélange de 100 grammes de benzonaphtol avec 0sr,01 de safranine se colore à 110 degrés, l’acide benzoïque (100 gr.) fusible à 121 degrés se colore à cette tempéra*

' En ouvrant trop hâtivement on risquerait de faire sauter les bouchons de ouate des récipients trop pleins.

STÉRILISATION

ture par le vert brillant (0er,01). On met le mélange dans une ampoule de verre scellée, dans l’autoclave. La matière colorante, masquée à l’état pulvérulent, colore le culot s’il s’est liquéfié (Demandre).

13) — Chauffage discontinu a + 100° ou au-dessous

Nous avons déjà dit que certaines spores microbiennes nécessitaient une température de -f- 120° pour être détruites1. Or, il est des milieux, employés couramment dans les laboratoires, qui ne peuvent supporter de pareilles températures. La gélatine, par exemple, ne peut être stérilisée à -f- 120°; elle ne peut même être soumise trop longtemps à + 100°; maintenue trop longtemps à cette température, elle ne se reprend plus en masse au refroidissement. Le sérum ne peut être porté à des températures dépassant -f- 70°, sans modifications qui rendent son emploi impossible. Il faut donc user d’artifices.

1° Chauffage discontinu de Tyndall. — Tyndall a imaginé, en 1877, le chauffage discontinu pour stériliser l'infusion de foin sans appareils spéciaux. Celle-ci, contenant des spores de B. subtilis, me pouvait être stérilisée par l’ébullition. Tyndall eut l'idée de la chauffer plusieurs fois de suite à + 100°. Le premier chauffage tuait les bacilles et respectait les spores: celles-ci germaient ensuite et le second chauffage tuait les jeunes bacilles ; au bout de deux -ou trois chauffages toutes les spores avaient germé et tous les bacilles en provenant avaient été tués ; l’infusion était stérile.

On se sert de ce procédé pour stériliser la gélatine. On la soumet à deux séances de stérilisation, de vingt minutes chaque, dans la vapeur à +100° (autoclave sans pression), l^a stérilisation est assurée, et la gélatine conserve ses propriétés.

1 Les spores de Bacillus mesentericus vulgaris peuvent même résister à -f 130°.

Il est aussi utile pour stériliser tous les autres milieux qu’on ne veut pas trop chauffer.

2° Stérilisation du sérum. — Koch a appliqué le principe de Tyndall à la stérilisation du sérum.

Lorsqu’on veut se servir comme milieu de culture du sérum provenant d’un sang recueilli sans précautions, à l’abattoir, par exemple, il faut tuer les germes qu’il contient. Or, le sérum se coagule à -f- 7(P ; on ne pourra donc atteindre cette température si on veut l’employer liquide.

Est-il destiné à être utilisé gélifié, le sérum ne peut cependant être exposé à des températures supérieures à + 75°, sous peine de devenir absolument opaque. 11 faut donc stériliser le sérum liquide à -f- 58°-60° et le sérum solide à 70°-75°. Le sérum est chauffé chaque jour pendant une demi-heure, à ces températures, et cela cinq ou six jours de suite (Koch).

Cette stérilisation à -f- 60° ne serait pas applicable à d’autres milieux que le sérum ; ce dernier n’est pas un bon milieu de culture pour la majorité des bactéries et sa stérilisation est plus aisée que celle du bouillon par exemple.

On emploie exclusivement aujourd’hui, du sérum recueilli aseptiquement (voir page 71), et n’ayant donc pas besoin d’être stérilisé.

C) — Pasteurisation

On désigne sous le nom de pasteurisation un mode de chauffage à une température inférieure à -f- 100°, capable d’arrêter pendant un certain temps la germination des microbes, sans toutefois aller jusqu’à la stérilisation absolue. Cette opération a l’avants^e de ne pas altérer les propriétés des liquides chauffés. Pasteur l’a appliquée à la guérison des maladies des vins. On l’emploie journellement pour le lait, qui peut ainsi être transporté au loin, la fermentation lactique étant retardée de quelques jours. La pasteurisation n’est qu’une stérilisation incomplète, elle intéresse l’hygiéniste plus que le bactériologiste.

STÉRILISATION

Nous répéterons, au chapitre m, à propos de chaque milieu nutritif, la méthode de stérilisation qui lui convient le mieux.

§ 2. — Stérilisation par les substances