Aiui. Insi. Pdslcur

méthylène, pour la coloration de flomanovsky. Enfin, en 191)6, MacNeal ', dans un travail très important, mais qui ne paraît pas avoir été suffl- . samment remarqué, a définitivement démontré l'importance du violet de métliylène. Non seulement Mac Neal confirme les vues de Unna sur la valeur tinctoriale de ce corps, mais encore il démontre qu'il peut remplacer l'azur dans la coloration de Romanovsky. Pappenheim - a tout récemment repris cette (juestion, confirmé les résultats de Mac Neal et expliqué le rôle du violet de méthylène.

Ce corps, agissant en présence du bleu de méthylène, possède les mêmes propriétés que l'azur (coloration spécifique de la chromatine des Protozoaires et des corps azurophiles), mais, de plus, il colore mélachromaliquement les granulations des labroc} tes. Il réunit en somme les propriétés du bleu de loluidine à celles de Tazur. Pourtant, il ne colore pas comme Tazur d'autres substances basopbiles non chromotropes et les colorations azurophiles qu'il fournit sont moins intenses que celles qu'on obtient avec l'azur.

Le point intéressant de l'histoire de ce corps, c'est la mise en valeur de son importance par Unna, Mac Neal et Pappenheim : il joue un grand rôle dans le bleu polychrome de Unna et dans les solutions de bleu de méthylène mûries par l'action des alcalis. Ce rôle a été longtemps méconnu. Unna, puis Pappenheim, ont bien montré que, dans le bleu polychrome de Unna, c'est le violet de méthylène et non l'azur qui est doué de propriétés métachromatiques. Si, dans ce hquide, on supprime le violet de méthylène, les granulations des labrocytes ne se colorent plus en rouge. En outre, Pappenheim a montré que, dans les vieilles solutions de Giemsa, il se forme toujours du violet de méthylène, par décomposition de l'azur.

Bleu polychrome de Unna. — Connaissant les propriétés de l'azur de méthylène et du violet de méthylène, nous pouvons étudier ce colorant célèbre. Nous avons dit qu'il est fabriqué en faisant agir du carbonate de potassium sur du bleu de méthylène en solution aqueuse, à la température de l'ébullition. Je n'en donne pas la formule, car c'est un réactif qu'il ne faut pas préparer soi-même, mais acheter tout fait chez Griibler.

1. Mac Neal, MeLhylenvioIct and methylenazur. Journ. infect, diseases, III, p. 41-2-433, 1906, très bonne analyse do M. NicoUe, dans Bull. Inst. Pasteur, p. 60-2, 1906.

2. Pappenheim, Panchrom, eino Verbesserung der panoptischen Universalfarblôsung fiir Blutpraparate jcder Art nebst Ausfiihrungen iiber metachromatisrhe Farbstotfe und die metachromatische Potcnz des polychromen Methylenblau. Folia hsematologica, XI, Archiv., p. 194-218, 1911.

Il renferme à la fois du bleu de mélhylène non transformé, de l'azur de mélhylène, sous forme de carbonate, el du viojel de méthylène. C'est un merveilleux colorant pour l'étude du tissu conjonctif, dans lequel il met admirablement en évidence les plasmocyles (p. 654), les labrocytes, les cellules conjonctives, etc. Le carbonate d'azur colore le granoplasma (partie granuleuse du cytoplasme des cellules conjonctives, d'après la conception de Unna), tandis que le violet de mélhylène met en évidence lespongioplasnia (partie réticulée du cytoplasme, d'après Unna) qui est coloré orthochromatiquemenl ^ et les granulations des labrocytes qui sont colorés métachromatiquemenl '.

De nombreuses modifications ont été proposées pour cette solution. Outre le bleu polychrome de Goldhorn (1901), qui est préparé avec du carbonate de lithium et le bleu polychrome de Martinotli (p. 384), nous mentionnerons le mélange d'azur de Unna (1904) :

Carbonate d'azur de méthylène 0,2o gv.

Carbonate de potassium 0,25 —

Violet de méthylène 1 —

Eau distillée. '. iOO —

Glycérine 100 —

Le bleu polychrome de Unna surcolore généralement les tissus; il faut donc différencier ^^ec l'élher glycérique de Unna (p. 427). Dans ce cas, on procède par la méthode régressive.

Pour les colorations progressives, on emploie encore le bleu boracique de Manson, qui renferme de l'azur et du violet de méthylène, comme toutes les solutions de ce genre.

Eau bouillante 100 cm-\

Borate de sodium 3 gr.

Bleu de méthylène de Hôchst 2 gr.

On dilue celte solution jusqu'à ce qu'elle devienne transparente ou bien on l'emploie concentrée.

Ce colorant est très voisin du bleu boracique de Sahli - :

Solution aqueuse saturée de bleu de méthylène. 3 vol. Solution aqueuse de borate de sodium à o p. 100. 2 — Eau distillée 5 —

1. Voir p. 366 la définition de ces termes. ■2. Ztsclir. f. wiss. Mikr., II, p. 49, 1885.

392 METHODES GENEiiALES

Les bleus alcalins de Loffler el de Kûhnc^ dont la conservalion est difficile, seront avanlageiisement remplacés par Taziir II alcaline de Giemsa fp. 389)

B. — Colorations régressives \

Nous savons déjà (p. 3G0) que les colorations régressives ne peuvent s''ap[)liquer qu'aux frottis et aux coupes très minces et bien uniformes, si on veut obtenir des résultats constants et comparables. Bien que les colorants agissent sans moi'dayit^ il est cependant certain que les matériaux fixés par les mélanges chromiques donnent de meilleurs résultats; à défaut de ce mode de fixation, on peut chromer par le Ghrombeize GAI de Hoclist (p. 364); la coloration sera à la fois plus intense et plus élective.

La concentration des solutions a une certaine importance : concentrées, elles colorent plus vite, mais moins électivement que des solutions étendues agissant lentement, comme le conseille Heideidiain (p. 361).

La différenciation s'effectue généralement avec de Falcool (à 90° ou absolu) et souvent avec de Talcool chlorhydrique à 0, 5 ou 1 p. 100. On a eu soin d'éliminer d'abord, par un lavage à Teau, Texcès de matière colorante. Il faut savoir que l'alcool chlorhydrique agit très rapidement et qu'il décolore la chromatine au repos avant les mitoses. On peut différencier aussi avec une autre couleur d'aniline, généralement un colorant acide.

Pour arrêter la différenciation^ on plonge les coupes dans l'eau ou mieux dans un liquide intermédiaire entre l'alcool et le baume. Le xylol (ou le toluène) est le plus employé : il arrête instantanément la différenciation et permet le passage rapide au baume. Beaucoup d'auteurs conseillent l'essence de girolle; dans certains cas, ce liquide peut compléter la différenciation, mais, à mon avis, son emploi est généralement une complication inutile, car il faut toujours l'enlever ensuite par le xylol ou le toluène.

Safranine. — Il existe un très grand nombre de safranines -. La meilleure est certainement la safranine 0 de Grùbler pour

1. Nous avons déjà dit que l'imporiance de ces colorations a beaucoup diminué, depuis l'apparition des méthodes à rhématox3linc ferrique.

2. Curtis a indiqué le moyeu dlsoler la base do la satranine, qui donne des colorations plus rapides et plus intenses. C. R. Soc. biol., LX, p. 983, lOOô.

COLORATIONS PAlî LES COULEUi;S D'AMLINE 393

coloration nuclL'aire. Il n'est pas toujours facile d'obtenir des solutions aqueuses concenlrées, anssi beaucoup d'auteurs conseillent-ils de faire des solutions hydroalcooliques.

Solutions de Babes. — Babes conseille, soit de mélanger parties égales de solutions concentrées aqueuses et alcooliques, soit de saturer de safranine de Tenu anilinée saturée. Persounellcment, j'ai obtenu de très bons résultats avec cette dernière formule. Quand on se sert de très vieille eau d'aniline, on obtient une coloration très rapide, en 5 à 10 minutes au lieu de 12 heures. Voici comment je procède : je prépare à l'avance, comme le conseille Duboscq, de l'eau anilinée saturée, en mettant dans un grand flacon de l'eau avec un excès d'aniline. Quand on veut faire une solution de safranine, on filtre la quantité voulue de cette vieille eau d'aniline et on la sature de safranine. Le colorant se conserve indéfiniment.

Solution de Zwaardemaker.

Solution alcoolique saturée de safranine } ~ Eau anilinée saturée ) *"

On recommande généralement do colorer au moins 12 heures, mais, avec la formule Babes-Duboscq, 10 minutes peuvent suffire. Le matériel qui se colore le mieux est celui qui a été fixé au Flcmming-; pourtant j'ai obtenu d'excellents résultats avec des pièces fixées au Bouin : on peut aussi mordancer par l'iode, suivant le procédé de Gram (p. 394), comme le conseillent Babes et Prenant.

La différenciation i se fait généralement à l'alcool absolu, mais, pour mettre les mitoses en évidence, on peut employer l'alcool chlorhydrique très faible (1 p. lOOOj.

Violet de gentiane. — Ce colorant n'est autre chose qu'un mélange de penlamélhylpararosaniline (violet de méthyle, violet de Paris) et de violet hexaméthylé ou cristal-violet. Je suis obligé de conserver le nom de violet de gentiane, qui est connu de tous, mais je conseille de remplacer toujours ce corps jiar le cristalviolet, qui est beaucoup i)lus pur et donne des colorations plus précises.

Ces divers violets s'emploient en solution aqueuse ou hydroalcoolique : il est bon d'y ajouter, comme accentuateur, de l'aniline ou de l'acide phénique. On obtient ainsi les violets aniline et phéniqué, colorants très employés en bactériologie et qui conviennent non moins bien en histologie.

Violet aniline d'Ehrlich. — Se prépare en ajoutant à de l'eau anilinée filtrée une solution alc()oli(iue saturée de violet, jusqu'à forma-

1. Voir, au sujet de la coloration par la safranine, Ssoboiew, Zur Tcchnik der Safraninfarbung. Ztschr. f. wiss. Mikr., XVI, p. '1-25-4-2Ô, I89.X

394 MKTHODES GÉNÉRALES

tion d'une pellicule irisée. Ce colorant ne se conserve pas et doit être préparé au moment de l'emploi.

Violet phéniqué. — Triturer dans un mortier :

Cristal-violet l gr-

Alcool à 90" ' 10 cm3.

Acétique phéniqué crist 2 gr.

On dissout d'abord le colorant dans l'alcool puis on ajoute peu à peu l'acide phéniqué. Quand le mélange est bien homogène, on rince le mortier avec de l'eau, par petites portions, qu'on reverse au fur et à mesure dans un flacon; il faut employer 100 ce. d'eau. On filtre après 24 heures de repos. Cette solution peut se conserver très longtemps lorsqu'elle a été bien préparée.

Dans certains ouvrages, on conseille de mélanger simplement une solution alcoolique de violet avec de l'eau phéniquée. A mon avis, ce procédé est mauvais : on obtient généralement un liquide trouble presque dépourvu de pouvoir colorant.

Ces violets s'emj)loienl comme la safranine ; on différencie par Talcool absolu, additionné d'acide clilorhydriqne (1 p. 1000) ou d'acétone (voir Gram-Nicolle). Les colorations sont des plus intenses, mais ne se conservent pas indéfiniment. A l'emploi des accentuateui's (aniline, acide pliéni(|ue) on joint très souvent le mordançage par l'iode, qui agit ici d'une façon particulière, connue sous le nom de méthode de Gram.

Méthode de Gram. — Elle repose sur ce fait que les couleurs dérivées de la pararosaniline (violet de gentiane, violets penta et hexaméth} lés, bleu Victoria) forment avec l'iode une combinaison que l'alcool ne peut dissocier. Certains éléments (chromatine en mouvement dans les figures de karyokinèse, certaines Bactéries) ont pour cette combinaison une affinité telle que l'alcool ne peut l'entraîner : on dit alors que ces eiémenis pi^enn en t le Gram. D'autres ne possèdent pas celte affinité, ne prennent pas le Gram, et abandonnent à l'alcool la combinaison iodopararosaniline. Celle-ci n'est pas dissociée, mais entraînée. La coloration des parties qui prennent le Gram est due, non au violet, mais à la combinaison iodée, car elles prennent une teinte bleu noir.

Cette réaction ne se produit pas avec les couleurs dérivées de la rosaniline (fuchsine, magenta, diamantfuchsine, solferino, etc.). Celles-ci forment avec l'iode une combinaison instable qui est dissociée par l'alcool : ce dernier entraîne l'iode et laisse la couleur

1. Beaucoup d'auteurs indiquent Talcool aljsolu. Je ne vois pas très bien pourquoi, car la couleur se dissout aussi bien dans l'alcool à 90° et il me semble inutile de prendre de l'alcool absolu pour l'hydrater ensuite.

dans le tissu qui est teint uniformément, sans différenciation. C'est donc un non-sens d'appliquer la méthode de Gram après une coloration à la fuchsine phéniquée. Théoriquement, si on se servait de ruhine hasique véritable, qui est un dérivé de la pararosaniline, on pourrait appliquer la méthode de Gram, mais les fuchsines basiques du commerce sont toujours un mélange de chlorhvdrates et d'acétates de rosaniline et de pararosaniline (p. 39è).

Technique de la méthode de Gram.