Francotte, Manuel de technique microscopique, cf. p

M. Lan'geron. — Précis de Microscopie. O

les deux cas en une même ligure. Soil un rayon lumineux ABCD, pénétrant en B dans la préparation : il est réfracté, se rapproche ainsi de la ligne médiane MM' et suit dans le verre la direction BG. En G il quitte le verre pour passer dans l'air et est de nouveau réfracté dans la direction GD. Il ne peut donc atteindre la lentille frontale de Tobjectif à sec. Le rayon EBG'FG qui possède exactement la môme incidence n'est réfracté qu'une fois, à son entrée dans la préparation, en B. Il continue ensuite sa marche en ligne droite à travers l'huile d'immersion et la lentille frontale, pour

Fig. 51. — Marche schématique dos rayons lumineux dans Tair et dans l'huile de cèdre, dans le cas d'un objectif à immersion homogène et d'un objectif à sec de même puissance. — Original.

contribuer à la formation de l'image. Un rayon lumineux encore plus oblique, qui suit le trajet HBIJK peut encore être recueilli par la lentille frontale. Un rayon de même incidence LBM subit la réflexion totale au moment de son passage de la lamelle dans l'air. On voit donc, par cette figure schématique, que les objectifs à immersion peuvent admettre un cône lumineux très large et que leur ouverture numérique est très supérieure à celle des objectifs à sec de même puissance.

L'emploi de l'immersion n'est possible qu'avec les objectifs à courte distance frontale, par conséquent à fort grossissement. G'esl d'ailleurs pour ceux-là seuls qu'elle présente un avantage, car les faibles objectifs sont toujours assez lumineux. Au delà d'un grossissement de 700 à 800 diamètres, l'emploi des lentilles à immer-

sioû devient absolument nécessaire pour avoir une image suffisamment lumineuse et nette, car les systèmes à sec n'admettent plus assez de rayons obliques nécessaires pour une bonne résolution.

Classification des objectifs à immersion. — On établit, parmi ces objectifs, aulantde catégories que de liquides d'immersion. Nous distinguerons donc les objectifs à immersion à eau, à huile de cèdre et à monobromure de naphtaline.

Les objectifs à immersion à Veau ne remplissent qirimparfaitemcnt le but de ces instruments, à cause de l'indice de réfraction de l'eau (n=l,33) trop diiïérent de celui du verre (n ^ 1,52). Néanmoins ces objectifs, à l'époque oii ils furent inventés, constituaient déjàiin progrès considérable. Ils ne sont plus guère employés maintenant. Il est rare qu'on puisse se permettre le luxe de cet accessoire. Pourtant ils peuvent rendre des services pour suivre la marche de la différenciation, au cours de certaines méthodes cytologiques. Dans ce cas, on peut les employer sans lamelle. Ils peuvent aussi être commodes pour l'examen de petits animaux aquatiques. Le liquide d'immersion doit toujours être de l'eau distillée, de façon à ce que son évaporatioti ne laisse pas, ù la surface des lentilles, de dépôt susceptible de les rayer.

Les objectifs à immersion à rhiiile de cèdre sont dits aussi à immersion homogène parce que l'huile de cèdre, ayant à très peu près le même indice de réfraction que le verre, les rayons lumineux traversent un milieu optiquement homogène. L'indice de réfraction de l'huile de cèdre est n = 1,515; celui du verre des lentilles est aussi de l,oi5; celui du verre des lames et lamelles est environ de 1,520. Pourtant les huiles de cèdre de diverses provenances ne sont pas identiques; il y a toujours entre elles quelque différence. Il est donc préférable d'employer l'huile de cèdre fournie par le constructeur de l'objectif et pour laquelle les lentilles ont été corrigées ^

Ces objectifs à immersion sont, à l'heure actuelle, de beaucoup les plus employés.

Nous ne signalerons que pour mémoire les objectifs à immersion au monobrornure de naphtaline. L'indice de réfraction de ce corps est n^= 1,06; il permet de porter l'ouverture numéri([ue à 1,63. Malheureusement ces objectifs n'ont guère d'utilité pratique, car, outre leur prix fort élevé,

1. Voir p. 445 Temploi de l'huile de paraffine comme liuile d'immersion. Le D'' Joyeux m'a indiqué, en outre qu'en cas de nécessité, il avait eu de bons résultats avec l'huile de Ricin officinale. Ces particularités sont intéressantes pour les voyageurs et explorateurs.

îls nécessitent des précautions particulières. L'objet doit être monté dans un milieu* excessivement réfringent tel que le monobromure de naphtaline, le biiodure de mercure, etc.; les lamelles doivent être en llint très lourd et avoir une épaisseur particulière. Le cône éclairant doit avoir une ouverture numéricjue de 1,40 et être fourni par un condensateur de flint. Les lames elles-mêmes doivent être en flint, alors que les lames et les lamelles ordinaires sont en crown. Ces objectifs sont donc plutôt des curiosités scientifiques, servant à déterminer les limites de la visibilité microscopique au moyen de Diatomées difficiles à résoudre.

Emploi des objectifs à immersion. — Nous donnerons plus loin, en parlant de l'emploi du microscope (p. 163), quelques conseils pratiques sur la manière d'employer les objectifs à immersion- Nous devons simplement examiner ici dans (|uels cas on doit se servir des objectifs à immersion de préférence aux objectifs à sec.

Nous avons déjà dit que pour un grossissement supérieur à oOO diamètres il était préférable d'employer les objectifs à immersion, qui sont plus lumineux et donnent une meilleure résolution. Pourtant il est des cas où les forts objectifs à sec sont plus commodes, car ils dispensent de l'emploi du liquide d'immersion. Un micrograpbe exercé saura tirer parti de l'appareil d'éclairage et obtiendra, avec un bon objectif à sec, d'aussi bons résultats qu'avec rimmersion. Néanmoins l'emploi de l'immersion est à conseiller à la majorité des travailleurs et des débutants, car il est assez difficile de trouver de très bons objectifs à sec puissants et encore plus difficile de s'en servir utilement.

Nous devons mentionner ici un dernier avantage des objectifs à immersion sur les objectifs à sec : c'est de permettre Femjdoi de lamelles d'épaisseur quelconque, sans nécessiter de correction-. Ceci nous amène à étudier l'intluence de l'épaisseur de la lamelle et les objectifs à correction.

Influence de la lamelle. Objectifs à correction. — Pour les objectifs à sec puissants, l'épaisseur de la lamelle a une importance beaucoup plus grande qu'on ne le croit généralement. Ces objectifs sont en effet corrigés pour une réfraction produite par des lamelles d'une épaisseur déterminée, généralement 170 a. Si on emploie des lamelles })lus épaisses ou plus minces, l'image est médiocre. Voici pourquoi.

La figure 52 représente une bimelle deux fois plus épaisse à gauche qu'à droite. 00 est le plan ({ui limite la lentille frontale de l'objectif. P est un point de l'objet d'où part un cône lumineux. Les rayons qui for-

ment ce cùne traversent la lamelle, puis en sortent par les plans AA et HB pour passer de nouveau dans Tair et de là dans l'objectif 00. Tous ces milieux font subir des réfractions aux rayons qui les traversent. Il en résulte que les rayons qui pénètrent dans l'objectif ont tous une direction dilférente.

Si on vient à prolonger ces rayons en arrière, après leur sortie du couvre-objet, on remarque qu'ils coupent l'axe optique en des points difTérents, et d'autant plus rapprochés de la lentille frontale que leur inclinaison ou leur obliquité est plus forte. De plus ces rayons viennent

^ig. 5-2.

Influence de l'épaisseur de la lamelle sur la raarclie des rayons lumineux (d'après Zimmermann).

couper Taxe en des points d'autant plus éloignés les uns des autres que la lamelle est plus épaisse : c'est ce que montre à l'évidence la compa-

raison des deux moitiés de la (igure.

Il résulte de ceci que, pour les objectifs puissants, dont le foyer est très court, l'image de l'objet est formée non par un point, mais par une série de points superposés le long d'une ligne verticale d'autant plus longue que la lamelle est plus épaisse et que Touverture de Tobjeclif est plus grande. Les rayons externes paraissent partir du point le plus élevé et Teffet définitif est de donner une image dépourvue de netteté, exactement cotiime si Tobjectif était corrigé par excès pour l'aberration de sphéricité.

Pour compenser cet inconvénient, on utilise la propriété que possède l'éloignement des lentilles de corriger l'aberration de sphéricité. On sait en elfet que, dans un objectif corrigé par défaut (fig. 30) les rayons marginaux coupent l'axe optique en un point plus rapproché de la lentille que les rayons centraux. Si, par la pensée, nous intervertissons les rôles, c'est-à-dire si nous considérons l'image comme l'objet et l'objet comme l'image, il devient évident que ce système, corrigé par délaut, peut réunir en un point le faisceau de rayons superposés le long de Taxe. Il suffira

donc, pour corriger la déformation due à Tépaisseur de la lamelle, d'augmenter la correction par défaut, d'autant plus que l'épaisseur de la lamelle est plus grande.

Dans ce but, certains objectifs sont munis de ce qu'on appelle une bague de correction, au moyen de laquelle on peut déplacer, d'une quantité donnée, les lentilles supérieures et les éloigner ainsi des lentilles inférieures. La figure 53 représente un objectif muni de sa bague de correction. Cette bague porte des divisions

dont chacune correspond à un déplacement d'un centième de millimètre. Un trait gravé sur la partie fixe de la monture permet d'arrêter la bague à un chiffre correspondant à l'épaisseur de la lamelle pour laquelle on veut corriger l'objectif. La correction doit toujours être faite pour les objectifs qui [)Ossèdeid la bague de correction. Une négligence à ce point de vue altérerait considérablement l'image et ferait jierdre à Tobjectif une partie de ses qualités.

Fig. 53. — Objectif à .„ x- j u- • j i n

correction de Zeiss. Mensuration de 1 épaisseur des lamelles. - — En tournant la Pour effectuer la correction, il est nécessaire de bague de correction connaître exactement l'épaisseur de la lamelle. on fait varier lécar- 11 existe un appareil spécial, dit calibre-cadran, temcnt entre la paire sorte de pince à ressort qui saisit la lamelle, supérieureet la paire dont l'épaisseur est indiquée par une aiguille inférieure de len- actionnée par la pince et parcourant un cadran

gradué. Un autre appareil plus simple est formé d'une vis pourvue d'un tambour gradué. Ces appareils sont gradués en centièmes de millimètre.

A défaut de ces instruments il y a plusieurs méthodes qui permettent de trouver assez facilement l'épaisseur des lamelles, même pour des préparations définitives, dont on ne peut les retirer.

Le moyen le jilus simple est de mesurer l'épaisseur du paquet et de diviser par le nombre de lamelles.

On peut aussi trier les lamelles d'après le son qu'elles rendent en tombant sur une table. Toutes les lamelles qui donnent le môme son ont à peu près la môme épaisseur. On superpose les lamelles ainsi triées, on mesure l'épaisseur du paquet et on divise l'épaisseur obtenue par le nombre de lamelles.

Une autre méthode consiste à employer les divisions gravées sur la tête ou le tambour de la vis micrométrique. Ces divisions, nous l'avons vu plus haut (p. 19), permettent, au moyen d'un index, de mesurer de très faibles déplacements verticaux de l'appareil optique. On met successivement au point la face supérieure et la face inférieure de la lamelle, en ayant soin de tourner la vis micromélrique dans le même sens. Pour

faciliter celte mise au point, il suffit de quelques grains de poussière sur les deux faces de la lamelle. Pour éviter l'erreur due à l'accommodation il est bon de se servir de l'oculaire micrométrique; grâce à la présence de l'échelle dans le plan focal, on sera sûr de ne pas suppléer à la mise au point en accommodant. La différence entre les deux lectures correspond, pour un objectif à sec, à l'épaisseur d'une couche d'air représentant Tobjet. Pour connaître l'épaisseur réelle d'une substance autre que l'air, il faut tenir compte de l'indice de réfraction (p. 190, fig. 114) de l'objet qu'on mesure. La formule suivante : D = nd. donne une évaluation très approchée de cette épaisseur. D est l'épaisseur cherchée, n l'indice de réfraction de l'objet, (/ la différence entre les deux lectures. Connaissant l'indice de réfraction, on peut avoir l'épaisseur réelle et inversement, connaissant l'épaisseur, on peut calculer l'indice de réfraction. Pour le verre des lamelles on peut prendre 1,3 comme valeur approchée de n.

Enfin Czapski ' a indiqué une méthode très précise pour évaluer exactement l'épaisseur de la lamelle d'une préparation. On prend, comme terme de comparaison, trois ou quatre lamelles, dont on a déterminé l'épaisseur exacte au moyen du calibre. On les mesure au moyen des divisions de la vis micrométrique, sans s'occuper de la valeur de ces divisions, puis on divise l'épaisseur réelle de ces lamelles par les chiffres obtenus pour chacune d'elles. La moyenne des quotients donne un coefficient qui servira pour corriger toutes les mesures faites avec la même combinaison optique, la même longueur de tube et le même éclairage.

Si on ne peut connaître l'épaisseur de la lamelle, on établit la correction par tâtonnement en tournant lentement la bague dans un sens ou dans l'autre, tout en regardant dans l'oculaire. On arrive ainsi à trouver le point ({ui donne pour l'image le maximum de netteté.

Les montures à correction sont réservées aux objectifs à sec ou à immersion à Peau. Les objectifs à immersion homogène se font toujours à monture fixe. En effet, à cause de l'homogénéité du milieu que traverse la lumière (verre-huile de cèdre- verre), la netteté de Timage est à peu près indépendante de Tépaisseur de la lamelle. D'autre part, une modification dans récartement des lentilles pourrait nuire à la correction des aberrations. Si l'épaisseur anormale du couvre-objet nécessitait une compensation, on aurait recours au tirage du tube du microscope.

Emploi du tube à tirage. — Nous avons vu plus haut (p. 18) que le tube à tirage du microscope porte une division millimétrique. Ce tirage n'est pas destiné à augmenter le grossissement, comme beaucoup de débutants le croient, mais bien à compléter la correction des objectifs. Dans le cas des objectifs à sec, le tirage sert particulièrement à compenser l'épaisseur des lamelles : on le

L Czapslvi, Die Bestimmung von Decliglasdicken an fertigen Pràparaten, Zeitschr. f. wiss. Mikr., V, p. 482-484, 1888.

raccourcit dans le cas de lamelles trop épaisses (lamelles de 200 à

250 [j.) et 011 rallonge dans le cas contraire (lamelles de 100 à 120 a).

L'emploi du tirage est surtout important avec les objectifs à immersion. Ces appareils sont corrigés ])our une longueur de tube déterminée, généralement 170 mm., dont il faut retrancher Tépaisseur du revolver ou du changeur à coulisse. Une différence de 10 mm. suffit pour donner des images très médiocres.

Il ne faut pas confondre avec le mécanisme des bagues à correction la monture

^'dc ztis7- E^Tai^sant spéciale de certains objectifs faibles, tels que

tourner la bague RR le a* dc ZcisS (flg. 54). CcS objCCtifs SOUt

on élève la paire su- constitués par dcux Icntillcs doublcs rnrune

perieure de lentilles \ i

(Z.) dans la position bague luobile permet d'écarter et de rapproz:/ indiquée par les ^q^^j. . ^^-^ obtient aiusi une série de ffros-

traits pointillés (grand. u

nat.}. sissemenls variés qui, pour un même ocu-

laire, vont généralement du simple au double. Ces objectifs sont très précieux pour les dessins qui doivent être exécutés à un très faible grossissement.