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Le fait pouvait être intéressant à contrôler chez les Corynébactéries, dont le pouvoir de fermentation visà-vis de différents sucres est bien connu.
A) Les corpuscules métachromatiques et le pouvoir
fermentatif
Les milieux de cultures solides étant particulièrement favorables à l’acquisition des granulations, nos observations ont été faites sur des cultures développées sur les milieux au sérum coagulé, additionné de sucre et tournesolé (milieu Costa), ce qui nous donnait l'avantage de surveiller la marche de la fermentation.
4° Corynebacterium commune. — Sur milieux glucosé, saccharosé ou maltosé : Après virage du tournesol, les granulations des bacilles sont aussi abondantes que sur les cultures originelles ;
2e Corynebacterium pseudo-diphteriticum. — Sur Costa phosphoré : pas de fermentation, mais acquisition de granulations ;
3° Corynebacterium diphteriæ. — Cette espèce attaque le glucose mais laisse intact le saccharose; or, soit en présence du premier sucre, soit en présence du second, on observe des granulations dès le début du développement.
Cultures sur Costa saccharosé : granulations constantes; fermentation exceptionnelle.
Particularités. — Au bout de quatre à cinq jours, formes atypiques et granuleuses décrites plus haut.
Au bout de dix jours : ces formes deviennent ramifiées et enchevêtrées : filaments plus ou moins segmen-
OU. El
tés, avec de grosses granulations dans les crosses lerminales (1).
Repiquage sur Costa saccharosé : même évolution.
Repiquage sur Costa glucosé : retour aux formes typiques longues, avec granulations bipolaires (2).
Les corpuscules métachromatiques peuvent donc être abondants, en l'absence de toute fermentation et, réciproquement, le phénomène de la fermentation n'est pas lié à l’apparition des granulations.
B) Les corpuscules métachromatiques et les formes végétatives
Une série d'observations va nous renseigner au sujet des rapports possibles entre les granulations et le polymorphisme.
1° En milieux liquides, troubles homogènes. — Les granulations se présentent avec une grande irrégularité, sans jamais être abondantes.
2° Dans les végétations de dépôts. — Les granulations demeurent assez rares : ces dépôts se produisent surtout et d'une manière précoce dans les bouillons phosphatés, dans les bouillons au poisson ou au thymus de veau.
3° Sur les voiles en surface. — a) Voile de formation tardive provenant spontanément d'une végétation de dépôt :
C. diphteriæ, ensemencé sur bouillon phosphaté, donne un dépôt précoce; le reste du liquide est limpide.
(1) Formes atypiques reproduites pl. IT, n° 1. . (2) Formes reproduites pl. I, n° 1.
ep" ver
Après vingt jours, voile en surface : formes longues, très granuleuses et très ramifiées.
(Bouillon ordinaire témoin : formes de dégénérescence, sans granulations.)
Repiquage du voile sur bouillon glycériné : dépôt précoce, granulations rares.
Après quatre jours : voiles avec formes en spatules très chargées en corpuscules métachromatiques. | b) Voile de formation précoce. — Culture en bouillon ordinaire de B. cutis commune. (Après passage, en sac de collodion, dans le péritoine d’un lapin.)
Après trente-six heures, voile très accentué et très dense : formes en spatules très larges et très granuleuses (1).
Repiquage en:bouillon ordinaire : voile au bout de vingt-quatre heures : formes en spatules larges et bourrées de granulations : beaucoup de bacilles en V ouvert, dont les branches libres contiennent de grosses granulations.
Repiquage en bouillon au poisson : dépôt précoce ; bacilles chromophiles, granulations assez rares.
On constate, par ces quelques exemples, une abondance remarquable de granulations chez les formes typiques et atypiques des voiles; par contre, une raréfaction notable de corpuscules métachromatiques chez les bacilles des végétations de dépôts.
C) Relations avec le pouvoir pathogène
Après beaucoup d’autres expérimentateurs, on se
(1) Formes alypiques reproduites pl. Il, n°2;
demande encore si les propriétés pathogènes ne correspondent pas, quelquefois au moins, à des variations morphologiques.
Les bacilles diphtériques et pseudo-diphtériques différent par des caractères biologiques très nets, mais on a vu que dans certaines conditions, l'aspect cytologique peut devenir un aspect trompeur quand il s’agit de les différencier.
Lesieur (1) a montré qu'un bacille diphtérique peut acquérir de la virulence sans prendre des granulations. Beauverie et Guilliermond (2) ont décrit pour Botrylis cinerea parasite des végétaux, une forme pathogène sans corpuscules métachromatiques et une forme saprophyte pourvue au contraire de ces corpuscules,.
On peut provoquer la mort du cobaye par l’inoculation d’un bacille diphtérique non granuleux.
Il restait à connaître le pouvoir pathogène de Corynebacterium pseudo-diphteriticum (type Hoffmann) après l’acquisition expérimentale de corpuscules métachromatiques.
Les bacilles pseudo-diphtériques utilisés dans ces expériences provenaient tous de porteurs de germes ou d’angines légères; toutes les fois que nous avons observé la présence d’abondantes granulations chez ces bacilles, nous avons vérifié leur pouvoir pathogène par l’inoculation aux cobayes.
1° Cobayes inoculés avec C. pseudo-dipht, ayant
(4) LESIEUR. Loc. cilal.
(2) BEAUVERIE et GUILLIERMOND. Centralblal. f. Bakt. 1903, abt, TT,
sun 26
acquis des granulations par cultures sur milieux Costa phosphorés : aucune réaction générale, ni locale ;
% Cobayes inoculés avee CG. pseudo-dipht., variétés avee granulations obtenues par repiquages simultanés ou symbiose, sur un même milieu :.aucune réaction générale, ni locale ;
3 Cobayes inoculés avec C. pseudo-dipht. présentant des granulations en cultures sur sérum de cobaye, trois repiquages successifs : mêmes résultats que précédemment :
4 Chimiotaxie positive vis-à-vis des phagocytes de cobaye.
Dans l’une des expériences de la première série, nous avons pu nous rendre compte, aussitôt après l’inoculation, de la rapidité de la phagocytose : une trace de la sérosité rosée provenant de la piqûre avait été recueillie entre lame et lamelle et coloré vitalement.
On voyait l'englobement des bacilles par les phagocytes et les granulations de ces bacilles pouvaient être distinguées nettement par la métachromasie.
Les corpuscules mélachromatiques ne semblent donc pas correspondre à une augmentation du pouvoir patho-
gène.
D) Relations avec la capacité de résistance
Si ces granulations paraissent être, chez d'autres microorganismes (levures, B. alvei), le produit d’une élaboration « prélude d'une fructification » (1), elles pourraient peut-être aussi, chez les corynébactéries,
(1) GUILLIERMOND, Loc. citat. ’ des Lt
Pr
représenter des matières de réserves ou une condensation protoplasmique nécessaires à des formes de résistance.
Nakanishi (1) émettait l'hypothèse que les corpuscules métachromaliques avaient une grande capacité de résistance.
1° Capacité de résistance aux actions biologiques
Sérums antagonistes.
a) Action du sérum antidiphtérique mixte (2), après coloration vitale: une préparation de C. diphteriæ (cultures de vingt-quatre heures) est montée dans du sérum physiologique, additionné d’eau distillée.
On voit tout d’abord la membrane bactérienne se colorer en bleu pâle.
Au bout de dix minutes, la teinte métachromatique des granulations est intense, le reste du bacille est en bleu clair.
Addition d’une trace de sérum physiologique à 9 0/00 : aucun changement.
Addition d'une goutte de sérum de cheval normal éclaircissemment lent, effacement de la teinte bleue (membrane) ; (durée de l’observation : 20 à 30 secondes).
Addition d’une goutte de sérum antidiphtérique mixte : accentuation rapide de la décoloration; en 10 secondes, le corpuscule métachromatique observé dimi-
(1) NaxanisH1. Loc. cilal.
(2) Sérum antitoxique et bactériolytique.
THÈSE
Le A) D
nue et semble fondre comme un sucre dans l’eau; en 15 ou 20 secondes, il a disparu tout à fait (3).
Cependant, le corps bacillaire reste entier; si, à ce moment, on ajoute à nouveau du bleu de Nil, on n’obtient plus aucune coloration métachromatique.
b) Sérum antidiphtérique mixle avant coloration. On prépare deux pipettes stérilisées. L'une est remplie avec une émulsion de bacilles diphtériques dans un mélange de sérum de cheval et d’eau stérilisée; l’autre, avec ce même mélange mais additionné de sérum antidiphtérique mixte. Les pipettes sont scellées et mises à l’étuve. Au bout de deux à trois heures on fait avec le contenu des colorations vitales :
Première pipette : bacilles normaux ; feinte métachromatique des granulations (frottis témoin = granulations abondantes) ;
Deuxième pipette : amas de bacilles incolores (frottis témoin = bacilles clairs sans granulation).
c) Sérum antilevure.
Un cobaye reçoit à plusieurs jours d'intervalle deux inoculations de cultures de levures riches en corpuscules métachromatiques.
Au bout de dix jours, par ponction du cœur, on recueille du sang pour en essayer l'action du sérum visà-vis des corpuscules métachromatiques des levures.
Une préparation de levure est colorée vitalement avec du bleu de Nil : teinte rouge des granulations animées
(3) À. MEYER. (Loc. cilat. p. 118.) Donne l'eau de javelle (hypochlorites alcalins) comme dissolvant la volutine des granulations de b. alvei.
LS
de mouvements browniens dans la vacuole de la cellule de levure.
L'addition- du sérum antilevure détermine l'arrêt des corpuscules métachromatiques, le virage de la teinte rouge en teinte bleue et une décoloration progressive mais incomplète. Une trace de sérum normal de cobaye ne produit qu'un éclaircissement léger.
Dans toutes ces observations il est à remarquer que
ce sont les granulations qui paraissent résister le plus longtemps à l'action décolorante des sérums antagonistes ou bactériolytiques.
A cause de l'impossibilité d'une nouvelle coloration après cette action, on peut, semble-t-il, admettre que la substance des corpuscules métachromatiques se dissout dans les sérums.
2° Capacité de résistance aux actions chimiques
a) On a vu plus haut que l’action des colorants vitaux, intéressant surtout les corpuscules métachromatiques, n’a aucune action nocive sur la vitalité des bacilles.
b) Dans une préparation de C. diphiteriæ colorée vitalement, on fait ruisseler entre lame et lamelle une trace de chloroforme : on assiste alors à l’envahissement de la préparation par une vague teintée en rose el tenant en suspension une infinité de petites sphères; ces particules nombreuses surtout aux limites de la vague, sont animées de mouvements browniens, comme les micelles d’un liquide colloïdal, ou comme les corpuscules métachromatiques dans les vacuoles des levures.
Les bacilles diphtériques paraissent décolorés,
Une préparation témoin faite avec du sérum physiologique, du bleu de Nil et une trace de chloroforme ne
donne pas ce phénomène.
3° Capacité de résistance aux actions physiques
(température)
On utilise deux souches de C. diphteriæ avec formes atypiques et ramifiées : on distingue de gros corpuscules métachromatiques inclus dans les crosses terminales plus ou moins épaissies. |
Ces massues sont peut-être douées d’une résistance particulière. Nous avons pratiqué pour cette épreuve le procédé indiqué par Lehmann et Neumann (1).
a) Les cultures développées sur milieu Costa saccharosé sont émulsionnées dans leur eau de condensation après addition de sérum physiologique.
On répartit dans quatre petits tubes (deux pour chaque souche) et on les soumet au bain-marie à 70°.
Au bout de deux minutes : on retire un tube de chaque culture et l’on ensemence (sérum et bouillon).
Au bout de huit minutes : même technique pour les derniers tubes; en 48 heures cultures sur sérum = résultats nuls; cultures en bouillon = légère végétation, en dépôt, de bacilles petits et sans granulations.
b) Même technique employée avec quatre autres souches de C. diphieriæ développées dans les mêmes conditions. Après 8 minutes à 80°, tous les ensemencements faits sur bouillon ordinaire ont été négatifs.
La résistance des formes particulièrement granweu-
(1) LEHMANN el NEUMANN. Loc. citat. p. 49.
LUCES ARE
ses n’est pas très marquée vis-à-vis des influences thermiques.
En résumé, on peut considérer les granulations des bacilles diphtériques comme le produit d’une élaboration cytoplasmique, exigeant pour se manifester des conditions trophiques favorables.
La présence des corpuscules métachromatiques n'est pas un phénomène concomitant avec la fermentation; elle se produit de préférence chez les formes de Corynébactéries végétant en surface; elle n’est pas liée aux variations du pouvoir pathogène des espèces.
Ces granulations sans doute contiennent des lipoïdes et sont chromotropes vis-à-vis de certains colorants : ce sont ces formations cytoplasmiques de la cellule bactérienne qui résistent le plus longtemps aux actions décolorantes des sérums antagonistes, mais elles ne montrent pas une capacité de résistance très grande vis-à-vis des influences thermiques.
Suivant l’opinion de certains auteurs, ces corpuscules métachromatiques représenteraient des matières de réserves qui seraient utilisées lors d’une division cellulaire active, par exemple la multiplication rapide des bacilles.
