CHAPITRE PREMIER

Technique.

Dans les recherches qui ont été entreprises sur la bactériologie du conduit génital, nous croyons que la différence des résultats obtenus tient surtout à la variété des techniques employées. Aussi pensonsnous indispensable de dire longuement comment nous avons procédé. Dans les chapitres suivants nous reviendrons sur les moyens dont nous nous sommes servi pour recueillir les sécrétions normales ou pathologiques examinées ; mais dans ce chapitre nous traiterons d’une façon générale des examens microscopiques des sécrétions étudiées, des cultures, et des inoculations pratiquées.

Toutes nos recherches ont été commencées le plus tôt possible après avoir recueilli la semence ; le fait de laisser pendant 12 ou 24 heures un produit à examiner dans une pipette faussant parfois beaucoup les résultats et rendant impossible la culture des espèces peu vivaces.

Examen microscopique. — Pour l’examen microscopique, les produits étaient étalés en couche mince sur lamelles, desséchés et fixés par les moyens usuels ; chaleur, alcool ou sublimé en solution saturée. Les colorations ont été faites par 1e violet de gentiane en solution hydro-alcoolique, par le bleu de Lœffler et par la méthode de Gram.

Nous croyons qu’il est souvent utile délaisser les lamelles se colorer longtemps dans certains liquides. Certains organismes se colorent, en effet, très difficilement, et nous n’avons pu colorer convenablement certaines espèces. L’expérience nous a montré que souvent dans ces cas, il s’était agi d’organismes anaérobies, et dans les examens ultérieurs, en poussant la coloration, nous avons pu apercevoir des organismes qu’une préparation rapide ne nous avait pas

montrés et que cependant les cultures anaérobies avaient permis d’isoler.

Cultures. — Tous les auteurs qui se sont occupés de la bactériologie des organes génitaux de la femme et en général tous ceux qui se sont occupés de la bactériologie des muqueuses ont été frappés de la richesse extrême des espèces bactériennes que l’examen direct permet de constater, et de la difficulté de retrouver en culture pure toutes les formes vues au microscope sur lamelles. Le plus souvent les auteurs se sont contentés d’ensemencer sur un seul milieu de culture, l’agar par exemple, qui permet à beaucoup d’espèces de se développer et les conclusions qu’ils ont tirées ne sont vraies que visà-vis de ce milieu. Cette manière de faire est insuffisante. Aussi avonsnous cherché dans chaque cas par la culture systématique sur des milieux très variés, à isoler toutes les espèces microhiennes même les plus fragiles, pour pouvoir les identifier.

Dans les premiers temps , nous ensemencions sur plusieurs milieux en culture aérobie, faisant chaque fois pour chaque milieu un assez grand nombre de tubes. Plus tard nous avons vu que cette technique était absolument insuffisante ; qu’il fallait pour chaque cas entreprendre une recherche aussi complète que possible des espèces anaérobies qui pouvaient se trouver dans les sécrétions examinées.

Les résultats de ces recherches ainsi pratiquées sont encore très incomplets. Quand on s’est occupé de la recherche des organismes anaérobies, on se rend compte, en effet, que souvent bien des espèces peuvent échapper, soit qu’elles meurent très rapidement, soit qu’il soit impossible de les obtenir à l’état de pureté. Aussi croyons-nous n’avoir que dans un nombre de cas restreints pu cultiver et isoler toutes les espèces contenues dans les produits examinés.

Un des grands défauts de notre méthode d’étude, aussi complète que possible, de chaque cas particulier, est la lenteur même du travail. Le grand nombre de tubes employés, la variété des milieux de cultures, la vérification des colonies, la séparation des espèces anaérobies n’autorisent que l'étude de quelques faits; mais nous croyons que quelques cas examinés aussi complètement que possible valent

plus que les longs tableaux d’examens bactériologiques donnés dans les littératures étrangères; tableaux qui portent souvent sur des centaines de cas étudiés fatalement d’une façon incomplète.

Cultures des microbes aérobies. — Nous avons toujours ensemencé sur un grand nombre de milieux dilférents, pour nous mettre dans des conditions capables de révéler les espèces aérobies les plus variées.

Ces milieux ont été : la gélose (1) au bouillon ordinaire peptonisé, le sérum de bœuf solidifié, la gélatine, delà gélose sur la surface de laquelle on avait répandu quelques gouttes de sang humain, la gélose sérum de Wertheim au sérum de sang de lapin, au sérum de sang de bœuf, et enfin la gélose mélangée avec un tiers du liquide d’ascite de provenance humaine (2).

L’expérience nous a montré que, pour l’isolement, la gélatine ne donnait aucun bon résultat, et que le meilleur moyen était d’employer concurremment la gélose ordinaire alcaline , le milieu de Wertheim, le sérum de bœuf solidifié, et l’agar avec lesang humain .

Les ensemencements étaient faits, soit en plaques dans des boîtes de Pétri, soit en stries, soit enfin parle procédé que Veillon (3) préconise dans sa thèse, pour isoler les microbes des angines.

Les boîtes de Pétri sont incommodes ; la dessiccation s’y fait très rapidement, les colonies dans l’épaisseur de la gélose ne se différencient pas assez facilement. Ce qui nous a le mieux réussi est, comme nous le disions, l’ensemencement, en surface, sur les milieux contenus dans des tubes assez larges, après dissociation préalable dans le liquide exsudé au fond du tube. On étale ainsi avec soin le pus sur le milieu nutritif, et on a de véritables plaques en surface. Les colonies sont en milieu humide, à l’abri des impuretés, et peuvent être facilement différenciées par leur aspect macroscopique et microscopique.

(t) Notre gélose est à 1 1/2 0/0, de sorte que la surface en est très humide, et qu’il reste toujours un peu d’eau au fond du tube.

(2) L’expérience nous a montré que le liquide ascitique des néphrites aiguës était le meilleur liquide organique à employer.

(3) A. Veillon, Recherches sur l’étiologie et la palhogénie des angines aiguës non diphtériques. Thèse Paris, 1894.

Il faut avoir soin, pour chaque milieu employé, de faire plusieurs tubes avec des quantités inégales de pus et de faire des dilutions de plus en plus étendues.

Toutes les cultures ont été portées à la température de l’étuve.

Après vingt-quatre heures, quarante-huit heures, etc..., nous prenions le signalement des colonies développées et par des réensemencements successifs, nous obtenions des cultures pures de tous les organismes qu’il était alors facile d’identifier. La pluralité des milieux employés nous mettait dans les meilleures conditions pour obtenir tous les microbes existants dans chaque cas.

Cultures des microbes anaérobies. — Dans un grand nombre de cas nous avons fait des ensemencements pour la recherche des anaérobies. Au début nous ne faisions pas systématiquement cette recherche, mais nous avons pu nous assurer par les résultats obtenus qu’il était indispensable pour les cas même les plus simples de se préoccuper de ces microbes, si on voulait se faire une idée complète du contenu bactérien d’un pus ou d’une sécrétion.

La technique que nous avons employée est un des procédés indiqués par Liborius (1), un peu modifiée et surtout appliquée à un but différent. Elle nous paraît la meilleure et nous croyons indispensable de la donner en détail.

Nous nous sommes servi pour ensemencer de gros tubes à essai que l’on remplissait jusqu’aux deux tiers au moins d’agar sucré. Notre agar était ainsi composé :

Viande de bœuf • . . 500 gr.

Eau 1 litre

Agar 12 gr.

Sel marin . n gf-

Peptone 10 gr.

Glycose 15 gr.

Nous nous arrangions pour que l’agar eut toujours une réaction alcaline.

On arrive en "procédant le plus rapidement possible à obtenir un

(1) Liborius, Beitrâge zur Kenntaiss des Sauerstoffbedurfaisses der Bakterien. Zeilsch. f. Hyg., Bd I, 1886.

milieu extrêmement transparent, indispensable pour bien distinguer les colonies de la profondeur du tube.

Il ne faut pas laisser le sucre se caraméliser, sans cela le milieu devient brunâtre et opaque ; aussi est-il bon de n’ajouter la glycose fondue qu’au moment où on colle l’agar avec l’albumine de l’œuf. 11 ne faut pas porter le mélange au delà de 120°.

11 est préférable de préparer à la fois 2 kilogr. d’agar, la recherche des anaérobies par cette méthode usant une grande quantité de milieu nutritif.

Ensemencement et isolement. — Les auteurs qui ont employé les tubes d’agar sucré ont souvent procédé par piqûre. Cette méthode qui permet la culture des microbes, rend à peu près impossible la séparation des espèces ; aussi nous servons-nous de la méthode suivante qui permet de séparer des colonies poussées dans la profondeur d’un milieu transparent.

On fait fondre les tubes au bain-marie, on attend l’ébullition de l’eau, puis on laisse refroidir les tubes, et au moment où ils vont se solidifier (38“-10‘’), on introduit la semence avec une pipette et on agite 1e mélange. Sans recharger la pipette, onia plonge successivement dans une série de tubes semblables pour obtenir des dilutions de plus en plus étendues. Après l’ensemencement, on met immédiatement les tubes dans l’eau froide pour solidifier rapidement le milieu.

Chaque organisme se trouve ainsi, à l’état isolé, disséminé dans l’épaisseur même de la gélose. La colonie à laquelle il donnera naissance sera donc pure et séparée. Selon le degré de dilution les colonies seront plus ou moins éloignées, et, si on a eu soin de faire des ensemencements en nombre suffisant, on obtiendra des tubes contenant une dizaine de colonies au plus. Il sera facile de saisir avec une pipette à longue effilure une colonie isolée sans toucher les autres (1).

(t) La technique que nous venons d’exposer rapidement a été donnée en détail par MM. Veillon et Züber dans un mémoire récent {Archives de médecine expéî'mien^aZe, juillet 1898). On trouvera dans ce travail un exposé critique des différentes méthodes de culture des microbes anaérobies et les raisons qui nous ont fait choisir le procédé que nous avons employé.

Les tubes sont placés dans l’étuve à 37°.

Les résultats sont très variables suivant le nombre et la nature des germes introduits.

Dans certains cas, aucun germe ne se développe, ce qui peut tenir ou bien à ce que le produit ensemencé était stérile ou contenait des microbes ne poussant pas sur ce milieu (gonocoque, bacille de la tuberculose, de la grippe, etc...).

Mais d’une façon générale, tous les microbes qu’ils soient aérobies, anaérobies facultatifs ou anaérobies stricts, poussent sur ces tubes. Les facultatifs se développent jusqu’au fond du tube ; les aérobies obligés, seulement vers la surface jusqu’à une distance variable suivant l’agar, le microbe ensemencé, etc...

Quant aux anaérobies stricts, leurs colonies cessent de se développer à un ou deux centimètres environ de la surface de l’agar à une distance également variable suivant l’espèce et le milieu. Chose remarquable, et que nous n’avons pu encore expliquer, il arrive souvent que les colonies les plus près de la surface et qui constituent généralement un plan parallèle à celle-ci, acquièrent un développement plus considérable que les colonies situées au-dessous.

Les produits ensemencés contenant le plus souvent des espèces, aérobies, on comprend que celles-ci lorsqu’elles sont facultativement anaérobies, gênent beaucoup pour isoler les anaérobies stricts ; aussi quand les ensemencements ont été trop abondants, il est impossible de se rendre compte s’il existe ou non des espèces strictement anaérobies poussées au milieu des autres espèces.

Cependant l’examen attentif de toute la série des tubes ensemencés permet souvent de supposer que certaines colonies de la profondeur sont des colonies de microbes anaérobies stricts. En effet, les microbes aérobies forment des colonies ayant le même aspect sur toute la hauteur du tube. Les anaérobies s’arrêtent à une certaine distance de la surface. Ce qui permet de se rendre compte de la proportion relative de chacune des espèces.

Les microbes aérobies se développent généralement plus vite que les microbes anaérobies dont beaucoup ne donnent de colonies visibles qu’après trois ou cinq jours.

Examen des colonies. — Dans les tubes où les colonies sont bien séparées, on peut facilement les examiner sous le microscope à un grossissement faible (obj. 0 ou obj. I) à travers le tube de verre couché sous l’objectif. Les colonies d’anaérobies ont quelquefois des aspects assez spéciaux ; mais le plus souvent rien ne les distingue des autres.

Pour faire des examens microscopiques, il faut puiser purement dans une colonie. Pour cela, on se sert de pipettes effilées (1) avec lesquelles on va toucher une colonie bien isolée et en ayant soin de ne pas toucher aux colonies voisines pour obtenir une préparation pure et d’autre part ne pas infecter le reste de la culture. Les jours suivants en effet il sera nécessaire de faire des prises successives pour examiner ou ensemencer les colonies qui apparaissent tardivement. Cette pêche est parfois assez délicate ; elle doit quand les colonies sont très petites, être faite sous la loupe ; elle nécessite parfois l’emploi d’un aide qui aspire dans la pipette, pendant qu’on maintient son extrémité effilée sur la colonie à saisir.

Il est d’autres difficultés qui ne sont pas spéciales à cette méthode, mais existent dans toutes les recherches de culture des anaérobies. La production de gaz est un fait des plus fâcheux pour l’isolement des espèces. Dans ce cas en effet, la gélose est fragmentée et dans les interstices comme à la surface s’amasse une certaine quantité de liquide exsudé du milieu sous l’effet de la pression. Il devient alors impossible d’aller cueillir une colonie sans qu’un peu de ce liquide qu’on est obligé de traverser, monte dans l’effilure et vienne ainsi souiller la prise qu’on voulait faire. Mais si on a eu soin de faire des dilutions suffisantes de façon à obtenir des tubes ne contenant que très peu de colonies, la production gazeuse est incapable de fendre la gélose et on peut saisir purement les colonies.

Coloration des espèces anaérobies. — Les espèces anaérobies sont souvent assez difficiles à colorer sur lamelles. En effet en même temps que la colonie, on étalé une certaine quantité de gélose qui se

(1) Ce procédé a l’avantage de ne pas sacrifier le tube, et est supérieur à celui qui consiste à découper en tranches minces l’agar préalablement sorti du tube par chauffage de ses parois.

laisse mal pénétrer par la couleur ou bien se colore trop fortement et empêche de voir les microbes qu’elle contient. Mais en dehors de cette gêne causée par l’agar, les microbes anaérobies se colorent d’eux-mêmes parfois très mal; quelques-uns même presque pas. Les couleurs qui nous ont le mieux réussi, sont encore le violet de gentiane, le Ziehl dilué, le bleu de Lœffler.

La manière dont les microbes anaérobies que nous avons rencontrés se sont comportés vis-à-vis de 1a méthode de Gram est à signaler. Cette méthode si précieuse pour la séparation grossière des espèces aérobies, perd ici un peu de son importance. Si beaucoup d’espèces réagissent d’une façon très nette, quelques-unes sont en quelque sorte indifférentes.

Culture sur agar ascite sucré en tures profonds. — Nous avons plusieurs fois ensemencé nos colonies anaérobies sur un milieu qui paraît souvent très favorable aux espèces délicates. Nous ajoutions à notre gélose sucrée fondue un quart de liquide d’ascite. Nous avons par ce moyen pu rajeunir des espèces que nous croyions mortes.

Culture sur gélatine sucrée en tubes profonds. — Ce milieu est très inférieur à l’agar ; il ne permet que le développement des espèces qui se développent à la température de la chambre.

Culture des anaérobies sur milieu liquide. — Les milieux liquides servent surtout pour les inoculations aux animaux. La manière de pousser des espèces anaérobies en milieu liquide, ne nous paraît pas un caractère différentiel important. Tous nos microbes se sont développés à peu près de la même façon. Il se forme d’abord de petits flocons nuageux dans la profondeur, flocons qui augmentent d’épaisseur, flottent dans le liquide, puis retombent au fond. Rarement le liquide est troublé uniformément ; quelquefois il se fait un très léger voile.

Nous avons employé comme milieu liquide le bouillon sucré alcalin, contenu dans des éprouvettes épaisses. Le vide était fait, aussi complètement que possible, à la machine pneumatique. Nous fermions ensuite à la lampe. Nous ne décrirons pas la technique de cette méthode qui est classique.