SPECTROSCOPIE

En Biologie la spectroscopie n’est le plus souvent regardée: que comme une méthode de diagnostic; on a recours au spectroscope pour identifier certains produits de l’économie animale ou végétale : sang, bile, chlorophylle. Et cependant la. méthode peut être beaucoup plus féconde ; une étude rapide. du pigment chorophyllien va nous montrer, en effet, que dans certains cas les bandes d'absorption correspondent bien: à un véritable phénomène énergétique, à un acte essentiellement vital:

I. Historique. — Brewsrer (1) signale, en 1834, la présence de bandes dans le spectre de la chlorophylle.

BecquereL (2), CnauraRD (3), TimrrraZer (4) revoient et préci-; sent la découverte du biologiste anglais.

… Puis très vite les savants orientent leurs brel du côté physiologique. ExGezmann en 1882 et Reinke l’année suivante

(1) Brewsrer. On the colours of natural bodies (7ransactions of the royal Society of Edimburgh, t. XIT, 1854).

(2) Actions des rayons différemment réfrangibles sur AgBr et Agl, influence des matières colorantes (Comptes rendus, t. LXXIX, 1874).

(3) Comptes rendus, 1873; Ann. de chim. et de phys., 1874.

(4) Thèse de Saint-Pétersbourg, 1871 et 1872, 1874, 1875.

émettent l'opinion que ces bandes sont en relation avec le phénomène d'absorption.

Timiriazer (1) en 1886 apporte une série de démonstrations à l'appui de cette hypothèse. Sous l’influence d’un réducteur (zinc et acide acétique), la chlorophylle devient jaune; en perdant sa couleur verte, elle perd également sa bande du rouge. Ce mélange ainsi jauni peut être conservé indéfiniment en présence d'acide carbonique à l’abri de la lumière ; il verdit au contraire très vite si on l’expose à l’action solaire, au contact de l’oxygène de l’air, et en même temps réapparaît sa bande caractéristique.

C'était établir une première relation entre la matière verte des végétaux et l'oxygène.

Puis il montre, en plaçant des parties vertes de plante, dans divérses régions du spectre, que c’est au niveau des bandes d'absorption que se produit le dégagement maximum d’oxygène au dépens de l'acide carbonique.

Dans ce même ordre d'idées, ENGELMANN constate que si on éclaire une culture de microbes aérobies (il opérait avec le bacillus amylobacter) avec ur spectre chlorophyllien, ces bactéries viennent se grouper suivant certaines régions axiales qui correspondent aux positions des bandes obscures où de l'oxygène se trouve mis en liberté.

On peut donc conclure que ce sont les bandes qui travaillent ; ce sont elles qui décomposent l'acide carbonique.

Quelques années plus tard, en 1890, Trmrrrazer (2) fit faire un grand pas à la question en démontrant qu’il existe une relation entre l’absorption lumineuse par les bandes et la synthèse amylacée.

Reprenant l’expérience de Becquerez il lui donne une forme plus concrète, car il la fait porter sur l’amidon et la feuille vivante.

Une feuille verte est placée sous un spectre continu pen-

(1) Comptes rendus, t. CIE, p. 686, (2) Comptes rendus. t. OX, p. 1346.

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dant quelque temps, puis dans l'obscurité. Si alors on la décolore à l'alcool et qu’on l’imprègne de teinture d’iode, on observe qu'aux régions où se trouvaient des bandes d'absorption, correspond un spectre dessiné en iodure d’amidon. Cette expérience démontre, pour les hydrates de carbone, que ce sont les bandes chlorophylliennes et par suite la lumière absorbée qui se trouve en relation avec le travail chimique de l'absorption.

On est conduit sans effort à généraliser et à étendre aux substances albuminoïdes et grasses ce qui se passe pour les hydrocarbones.

Le phénomène spectroscopique prend ainsi une importance considérable au point de vue biologique. Si, en effet, la bande d’absorption s'accompagne de telles manifestations vitales (décomposition de Co? avec fixation de carbone et élimination d’oxygène, production rapide d’amidon), il devient clair qu’il s’agit de propriétés appartenant à la substance fondamentale de la vie, au protoplasma cellulaire luimême.

Dès lors on s'explique la théorie de PriNGsuerm (1), d'après laquelle Ia matière verte n'est qu'un écran derrière lequel se passent les actions de la vie ; la chlorophylle serait donc seulement chargée de tamiser une lumière favorable pour le protoplasme. Elle est cependant incomplète; les bandes ne . sont pas seulement des écrans, elles sont aussi et surtout des surfaces d'absorption des radiations nécessaires au fonctionnement du protoplasme ; l'expérience si intéressante de FamiTzinE (2) sur l'orientation des grains chlorophylliens ne contredit nullement cette façon de voir.

Telle est la conception biologique actuelle du phénomène physique de la bande d’absorption : elle est solidement étayée sur de nombreuses expériences.

(1) Ueber lichtwirkung und chlorophyl funktion in des l'flanse Monatsber. d. Bert. Akad., juil. 1879.

(2) Ann. des sc. nat.[5],t. VIL 1865.

émettent l'opinion que ces bandes sont en relation avec le phénomène d'absorption.

Timiriazer (1) en 1886 apporte une série de démonstrations à l'appui de cette hypothèse. Sous l’influence d’un réducteur (zinc et acide acétique), la chlorophylle devient jaune; en perdant sa couleur verte, elle perd également sa bande du rouge. Ce mélange ainsi jauni peut être conservé indéfiniment en présence d'acide carbonique à l'abri de la lumière ; 1l verdit au contraire très vite si on l’expose à l’action solaire, au contact de l’oxygène de l’air, et en même temps réapparaît sa bande caractéristique.

‘était établir une première relation entre la matière verte des végétaux et l'oxygène.

Puis il montre, en plaçant des parties vertes de plante, dans diverses régions du spectre, que c’est au niveau des bandes d'absorption que se produit le dégagement maximum d’oxygène au dépens de l’acide carbonique.

On peut donc conclure que ce sont les bandes qui travaillent ; ce sont elles qui décomposent l’acide carbonique.

Quelques années plus tard, en 1890, Timrrrazer (2) fit faire un grand pas à la question en démontrant qu’il existe une relation entre l’absorption lumineuse par les bandes et la synthèse amylacée.

Reprenant l'expérience de Becquerez il lui donne une forme plus concrète, car il la fait porter sur l’amidon et la feuille vivante.

Une feuille verte est placée sous un spectre continu pen-

(1) Comptes rendus, &. CIF, p. 686, (2) Comptes rendus. t. OX, p. 1346.

dant quelque temps, puis dans l'obscurité, Si alors on la décolore à l’alcool et qu’on l’imprègne de teinture d’iode, on observe qu'aux régions où se trouvaient des bandes d’absorption, correspond un spectre dessiné en iodure d’amidon. Cette expérience démontre, pour les hydrates de carbone, que ce sont les bandes chlorophylliennes et par suite la lumière absorbée qui se trouve en relation avec le travail chimique de l'absorption.

On est conduit sans effort à généraliser et à étendre aux substances albuminoïdes et grasses ce qui se passe pour les hydrocarbones.

Le phénomène spectroscopique prend ainsi une importance considérable au point de vue biologique. Si, en effet, la bande d’absorption s'accompagne de telles manifestations vitales (décomposition de Co? avec fixation de carbone et élimination d’oxygène, production rapide d’amidon), il devient clair qu'il s’agit de propriétés appartenant à la substance fondamentale de la vie, au protoplasma cellulaire luimême.

Dès lors on s'explique la théorie de Prinasueim (1), d'après laquelle Ia matière verte n'est qu'un écran derrière lequel se passent les actions de la vie; la chlorophylle serait donc seulement chargée de tamiser une lumière favorable pour le protoplasme. Elle est cependant incomplète ; les bandes ne . sont pas seulement des écrans, elles sont aussi et surtout des surfaces d'absorption des radiations nécessaires au fonctionnement du protoplasme ; l'expérience si intéressante de FamirziNE (2) sur l’orientation des grains chlorophylliens ne contredit nullement cette façon de voir.

Telle est la conception biologique actuelle du phénomène physique de la bande d’absorption : elle est solidement étayée sur de nombreuses expériences.

(1) Ueber lichtwirkung und chlorophyl funktion in des l’flanse Monatsber. d. Bert. Akad., juil. 1879.

(2) Ann. des sc. nat.[5],t. VIL 1865.

DR Pt

Doit-on la généraliser et l’étendre aux pigments du règne animal, par exemple aux pigments sanguins et biliaires. On y serait conduit par des raisons d’analogie et aussi en se basant sur la remarque suivante : c’est que les substances pigmentaires actives, susceptibles de jouer. un rôle dans l’organisme et par suite de subir des modifications possèdent un spectre d’absorption (sang, bile); au contraire les pigments dont l’évolution est achevée ou qui servent d'ornement en sont ordinairement dépourvus (bilirubine, pigments orangés des caroncules de pintades, pigment jaune du bec et des pattes des oiseaux, que nous étudierons plus loin).

Mais si la chlorophylle conduit à la conception des bandes telle qu’elle a été exposée plus haut, on ne voit pas nettement de relation aussi étroile en ce qui concerne le sang et la bile. Quoiqu'il en soit, l’étude des bandes d’absorption de ces deux liquides biologiques présente par elle-même un très grand intérêt scientifique. En collaboration avec A. Vira, nous avons traité longuement de la spectroscopie du sang et de l’hémoglobine ; ici nous ne nous occuperons que de la bile. |

Avant d'entrer dans le vif du sujet nous croyons nécessaire et utile de préciser certains points de technique fort impor tants et qui offrent de réelles difficultés en biologie.

IT. Technique. — Examinons brièvement. quelques-unes.des conditions les plus favorables pour que les observations spectroscopiques soient aussi rigoureuses et complètes que possible. Nous supposons, bien entendu, qu’on dispose d’un bon appareil possédant un excellent prisme et.qu'il a été réglé au minimum de déviation.

15 La fente du collimateur doit être choisie bilatérale, c’està-dire que l’écartement des lèvres donnant accès aux rayons lumineux doit se faire symétriquement par rapport à un plan médian. Avec les fentes unilatérales on est exposé à des erreurs dans lPappréciation de la situation, de l’étéendue et l'intensité des bandes d'absorption. Il peut, en effet, se pro-

PR ue

duire des déplacements notables, et cela d'autant plus que l’on ouvre plus largement la fente. Telle bande dont l'axe est par par exemple À = 600 avec une faible ouverture, devient À — 610 après une ouverture moyenne et même À = 615 au maximum d'ouverture. Avec une grande habitude, on parvient sans doute à corriger ces écarts ; il suffit, après avoir observé une bande en grande lumière de la ramener, par une fermeture progressive de la fente, à sa véritable situation une première fois répérée en éclairage convenable. Mais la manœuvre est toujours délicate lorsqu'on a affaire à des solutions fortement absorbantes par suite de leur concentration ou-de leur insuffisante limpidité, ce qui est le cas le plus fréquent pour les liquides organiques, sang, bile, etc. On évite ces inconvénients par l'emploi des fentes bilatérales.

2° Le choix de la graduation micrométrique a également une certaine importance à la fois pour la lecture personnelle des observations, et pour leur interprétation identique par tous, Si l’on adopte d'une façon générale la raie D du sodium, comme repère dans les descriptions spectroscopiques, le plus souventla même harmonie n’existe pas au sujet de la graduation micrométrique vis-à-vis de cette raie. Tel auteur fait coïncider avec D le chiffre 60, tel autre le chiffre 80 de son micromètre. Une convention uniforme rendrait un réel service en facilitant la compréhension et la comparaison des observations de chaque auteur. Au laboratoire de M. Erarp nous avons, l'habitude de régler l’appareil de façon que le chiffre 100 du micromètre coïncide avec la raie D du spectre de : FRAUENHOFFER. 3° Tandis que les raies brillantes des spectres des métaux ou des métalloïdes sont faciles à répérer et à traduire en longueurs d’onde, les difficultés en ce qui concerne les bandes d'absorption sont parfois fort grandes. Ces dernières offrent toujours l'aspect de plages obscures plus ou moins étendues. L’intensité d'absorption rarement uniforme, varie le plus souvent avec la quantité de matière optiquement active. Les bords d'une bande peuvent être très nets, taillés à pic pour

Rae ee

ainsi dire, ou au contraire très vagues, estompés et comme

dégradés. Dans ces conditions nettement variables la détermination d'une bande d’absorption est toujours fort délicate. La

plupart des auteurs évitent ces difficultés en se servant comme

points de repère des lettres A, B, G, D, E, F du spectre de

FrAuENHorrER ; telle bande est comprise entre B et C, etc., telle autre voisine de F, etc. On parvient cependant à la précision

nécessaire en adoptant, pour désigner une bande, l’axe de

celle-ci. Cet axe qui, étant donné son nom, représente sensi-

blement le milieu de la bande doit être recherché expérimen-

talement dans chaque cas particulier. Prenons un exemple,

soit à trouver l’axe de la bande & de l’hémoglobine, Pour ce

faire, partant d’une solution donnée de ce pigment, nous la

diluerons jusqu’à ce que la bande « ait été réduite à son mini-

mum d’étendue, qui coïncide avec la limite de visibilité et

se rapproche assez près de la raie spectrale, l’axe est au

Pour les bandes uniformément obscures, l’axe représente le milieu de celles-ci, milieu qui correspond au maximum d'absorption.

Pour celles dont un des bords est plus foncé que l’autre, l’axe est ordinairement plus près de ce bord.

D'une façon générale l’axe expérimental d’une bande représente la ligne d’absorption maxima.

La détermination de cette donnée à une importance en ellemême et parce qu'elle apporte avec elle la connaissance précise de la longueur d’onde moyenne des radiations absorbées par une matière.

4° Enfin pour qu’une observation spectroscopique soit complète il est nécessaire que soit défini, délimité le champ du spectre éclairé. Très souvent, en effet, le rétrécissement aux deux extrémités du spectre visible donné comme caractère spectroscopique d’une substance est dû non à une absorption spécifique, mais à une insuffisance d’éclairage ou à une trop grande concentration. Supposons que l’on examine une solution de chlorophylle dans de l'alcool ou de la benzine ; si la