D. CULTURE DE TISSUS DE CROWN-GALL

Les travaux fondamentaux d'Erwn Swira ont établi que les volumineuses tumeurs qui apparaissent fréquemment au collet de certains arbres et que l’on désigne pour cela sous le nom de «Crown Gall», sont causées par une bactérie spécifique : le Phytomonas tumefaciens. H est facile de reproduire ces tumeurs chez un grand nombre de plantes, en leur inoculant cette bactérie. Ware et Braun (81) ont pu, par divers artifices, éliminer la bactérie des tumeurs d’Hehianthus annuus et de Vinca rosea et cultiver ensuite sans difficulté leurs tissus sur des milieux ne contenant pas d’hétéroauxine, alors que les tissus normaux de ces plantes sont, dans ces conditions, incapables de se développer; les tissus tumoraux semblent donc capables de proliférer in vitro beaucoup plus facilement que les tissus normaux correspondants. Les tentatives de Ware et Brauv nous ont incité à effectuer des cultures de tissus de «Crown Gall» de diverses plantes, soit dans le but de la comparer aux cultures de tissus normaux, soit pour réaliser la culture de tissus d’espèces dont la culture des tissus est difficile comme ceux des Malvacées ou de Tabac.

L Cucrure De issus De Crown Gazz DE Viris vivirer4. L. —— — a. Caractères morphologiques et physiologiques. — Dans les conditions naturelles la Vigne est très rarement attaquée par le Phytomonas tumefaciens. Des tumeurs causées par ce parasite ont cependant été signalées à plusieurs reprises par E. F. Surrx et ses collaborateurs (70), par L. Nrewever (57) et Less (40). Ces auteurs ont pu reproduire expérimentalement des Crown-Galls sur divers cépages en leur inoculant la bactérie extraite de ces tumeurs. Nous avons nous-mêmes observé une très volumineuse tumeur spontanée sur un cep âgé (pl. XIIL, fig. À) et nous avons pu en extraire une souche virulente de Phytomonas tumefaciens. Nous avons également tenté à plusieurs reprises d'obtenir expérimentalement des tumeurs sur la Vigne; après de nombreuses tentatives infructueuses, nous y sommes finalement parvenu en inoculant la souche de Phytomonas tumefaciens À 6 de Rixer à de jeunes tiges de Vigne cultivées en serre. Ces tumeurs

se sont développées très lentement et ne sont jamais devenues aussi volumineuses que

celles que l’on obtient en inoculant des plantes très sensibles comme le Soleil ou le Pelargonium. Après deux mois, les plus volumineuses atteignaient à peu près 0,5 cm. de diamètre ; elles étaient de forme très irrégulière, profondément lobées et couvertes d’un liège épais, même lorsque les régions normales du sarment en étaient encore dépourvues (pl. XIIL, fig. B). Nous avons pu prélever asepti quement de petits fragments des régions internes de ces tumeurs et nous les avons ensemencées sur des milieux dépourvus d’hétéroauxine. Ces fragments s’y sont développés rapidement et ont formé des masses volumineuses peu mamelonnées de tissus translucides recouvertes d’une mince couche de cellules brunes d’aspect subérifié (pl. XIV, fig. A). Nous avons pu très aisément en isoler une souche qui est actuellement âgée de deux ans et a subi 12 repiquages. Afin d'étudier les réactions de ce tissu tumoral vis-à-vis de l'acide naphtyle acétique, nous l'avons repiqué sur une gamme de milieux renfermant des doses d’hétéroauxine allant de 107 à 1075, ainsi que sur des témoins n’en contenant pas. Nous avons alors constaté que ces tissus tumoraux sont absolument insensibles à l’action excitoformatrice de l’hétéroauxine, et réagissent seulement à son action toxique qui se manifeste à partir de 1077. Ainsi par leurs caractères physiologiques ces tissus se montrent très différents des tissus normaux et sensibilisés de Vigne qui sont très sensibles aux effets excitoformateurs de l’hétéroauxine (fig. 16). Par contre ils se rapprochent beaucoup des tissus accoutumés qui eux aussi ont perdu toute sensibilité vis-à-vis de cette substance de croissance et prolifèrent très rapidement sur des milieux qui en sont dépourvus.

b. Structure anatomique. — Ces colonies tumorales sont constituées d’un parenchyme à grandes cellules qui prend naissance à la suite de la division active d’une zone ménistématique qui est située à la périphérie du cal et l'entoure entièrement. Ce parenchyme est très homogène. Il ne renferme que quelques rares flots de cellules qui se lignifient, les autres demeurent constamment indifférenciées (fig. 27).

IL. Cucrure De issus pe Crown Gaz D’Agurizon Avicennar Gant. — À la suite des résultats peu encourageants fournis par nos premières tentatives de cultures de tissus de Malvacées, nous avons songé à cultiver non plus le tissu normal, mais le tissu tumoral, espérant obtenir ainsi plus facilement des cultures de tissus de ces plantes. Nos essais ont porté sur la Rose trémière (A/thea rosea Carr), la Guimauve (Alihea officinalis L.), la Guimauve de Thuringe (Althea thuringiaca L.) et l’Abutilon d’Avicenne (Abutilon avicennae Gaertn.). Pour cela au printemps, nous avons semé en serre des graines de ces trois espèces Un mois et demi plus tard, lorsque les plantules avaient atteint la taille d’une dizaine de centimètres, nous leur avons inoculé le parasite en traversant la tige de part en part, à un centimètre environ du sommet, avec une aiguille chargée de bactéries. La culture (souche A.6 de Rixer) était âgée de vingtquatre heures au moment de l’inoculation et avait été repiquée au préalable pendant quinze jours toutes les quarante-huit heures.

a. Caractères morphologiques et physiologiques. — Nous n'avons obtenu de tumeurs volumineuses qu'avec une seule espèce : l’Abutilon avicennae Gasrmn. Ces tumeurs se développèrent rapidement sur des plantules au point d’inoculation et au bout de deux mois, elles avaient atteint 1 centimètre à 1,5 cm. de diamètre. Nous les avons alors mises en culture après les avoir stérilisées suivant la technique habituelle. Nous avons utilisé pour cela trois types de milieu; l’un ne contenait pas d’hétéroauxine et les deux autres renfermaient de l'acide naphtyle acétique aux concentrations de 10-7 et 5.10-7, La moitié

PI RXIVE

J. Vincent, phot.

Fic. À. — Culture de tissus de Crown Gall de Vigne âgée de deux mois provenant d’une souche âg

de six mois (4° repiquage). Elle forme une masse peu mamelonnée de tissus translucides.

J Vincenr, phot

Fic. B. — Culture de tissus de Crown Gall de MNicotiana tabacum âgée d’un mois provenant d’une souche âgée de deux ans (12° repiquage).

ANNALES DES ÉPIPUYTIES. Page 74.

environ des cultures furent contaminées par le Phytomonas tumefaciens et périrent ; les autres, demeurées aseptiques, ne tardèrent pas à se développer. La surface du fragment se couvrit de petits tubercules brillants qui grossirent rapidement et formèrent en deux mois de volumineux mamelons. Toutes les cultures stériles se sont développées très régulièrement. Nous n'avons pas observé de mortalité, ni d’irrégularité de croissance comme nous en avions rencontré au cours des premiers repiquages des cals qui se forment normalement sur les tiges des autres Malvacées que nous avions étudiées.

Nous n'avons pas étudié de façon systématique l’action de l’acide naphtyle acétique sur ces.tissus. Nous avons simplement constaté que la croissance des colonies cultivées en présence de ce produit paraissait identique à celles des cultures qui n’avaient jamais

subi son action; aussi par la suite nous les avons repiquées sans incorporer d’hétéroauxine aux solutions nutritives. Certains explantats renfermaient encore des cellules de Phytomonas, car, au cours du second repiquage, nous avons constaté que certaines cultures

De.

ED

Fic. 27. — Vaisseaux aberrants se formant dans une culture de tissus de Crown Gall de Vitis Vinifera.

étaient contaminées par ces bactéries (environ 20 p. 100). Mais par la suite, nous n'avons jamais vu réapparaître de Phytomonas dans nos cultures. La facilité avec laquelle nous avons pu cultiver les tissus de tumeur d’Abutilon et la croissance homogène de ces cultures contraste avec les difficultés que nous avons rencontrées avec les tissus normaux des autres Malvacées et montrent que la transformation tumorale est avantageuse pour les cultures de tissus. La souche que nous avons isolée est actuellement âgée de trois

ans (juin 1948) et a subi 18 repiquages.

b. Structure anatomique. — La structure anatomique des cultures de tissus de Crown Gall d’Abutilon est très différente de celle des cultures de tissus de Crown-Gall de Vigne, mais se rapproche beaucoup de celles que Gauraerer (24) a signalé sur les cultures de tissus de tumeurs de Topinambour et de Soleil. Get auteur a, en effet, constaté que, dans les colonies tumorales, les cellules ligneuses ne sont plus associées à des éléments libériens et qu'il est impossible d’y déceler des tubes criblés, soit par des examens directs, soit à l’aide du réactif iodo-ioduré qui rend ces éléments très visibles, en colorant en rouge les grains d’amidon spéciaux agités du mouvement brownien qu'ils renferment normalement. Les cultures de tumeurs d’Abutilon sont de ce type. Elles ne renferment pas de formations cribrovasculaires, mais elles sont constituées par un simple parenchyme au sein duquel se différencient de très nombreuses cellules ligneuses disposées absolument au hasard. Ces cultures sont toujours massives, fermes et compactes, et ne pré-