CHAPITRE I

. DOSAGE DE L'ACIDE F-HYDROXYBUTYRIQUE EN SOLUTIONS PURES ADDITIONNÉES DE SUBSTANCES POUVANT SE RENCONTRER DANS L'URINE

Introduction. — La technique que nous avons proposée pour doser l'acide 6-hydroxybutyrique en solutions pures par action du réactif de NEssLer, fournit des résultats plus précis que les techniques basées sur l'oxydation chromique en acétone qui donnent des chiffres *__ -entachés d’une erreur par défaut d’au moins 20 p. 100. Sur des solutions pures la technique au réactif de NEssLeR est un peu moins régulière et précise que la technique basée sur la réduction de solutions nitrochromiques mais nous avons signalé que cette dernière technique était trop peu spécifique pour se prêter à des applications biologiques.

Nous avons donc cherché à doser l’acide 6-hydroxybutyrique dans urine à l’aide du réactif de Nesser. Nos essais ont débuté par des recherches préliminaires où nous avons étudié l’influence de composés normaux et pathologiques de l’urine sur le dosage de l’acide 8- Re . xybutyrique par le réactif de NEssLer.

Pour certains de ces constituants nous avons comparé leur os sur le dosage de l'acide B-hydroxybutyrique par notre technique et par celle de Vax Siyxe (1). Nous avons constaté que dans la plupart des cas la nôtre était plus spécifique.

Les principaux corps qui peuvent être associés à l’acide 8-hydro- . xybutyrique dans l’urine sont les corps cétoniques. Nous avons donc tout d’abord cherché à doser des mélanges d’acétone et d'acide B- hydroxybutyrique, puis ensuite d’acide acétylacétique et d’acide RUE RP

(1) Pour la technique de Van SLvyke, se reporter aux « Fiches tech- : Hi de CEE biologique » de M. le Professeur FLEURY (19).

LT

Dosage de mélanges d’acétone et d'acide 6-hydroxybutyrique.— Voici le principe de nos essais : Par addition de réactif de Ness- LER au mélange des deux corps, l’acétone est précipitée presque immédiatement. La solution filtrée est alors portée à 1009 et l’acide Bhydroxybutyrique donne à son tour la combinaison acétonique. Nous avons tout d’abord recherché si la précipitation de l’acétone n’induisait pas celle de l’acide B-hydroxybutyrique.

19 Influence du temps de contact. — Nous mélangeons 1 cm? de solution d’acétone à 1 gr. 20 pour 1000, 1 cm? de solution d’acide B-hydroxybutyrique à 2 grs 08 p. 1.000, 8 cm® d’eau, 7 cm5 de solution mercurielle et 10 cm3 de lessive de soude à 10 p. 100 en poids.

Nous centrifugeons après un temps de contact variable et portons le liquide décanté 4 heures à 1000. L’acétone des deux précipités mercuriels, celui obtenu à froid et celui obtenu à chaud, est dosée comme. de coutume (Tableau XX VIT).

. TaBLeaAu XX VII

Dosage d'un mélange d’acétone et d'acide G-hydroxybutyrique … par le réactif de Nessler en fonction du temps de contact.

Durée de contact (en minutes) 1 5 45 30 |

Millisgrammes d’acétone précipités à froid (Théorie : 1,21)... 4,19 122 4,20 4,24

Milligrammes d’acide B-hydro- | xybutyrique précipités à chaud (Théorie : 2,08) (1) .,.1:..... 241% 41794 213 2,06

(1) Nous admettons qu’une molécule d’acide B-hydroxybutyrique F {fournit une molécule d’acétone : de ce fait la consommation de 1 cm" | d’iode N/10 correspond à 1 mgr. 7333 d’acide B-hydroxybutyrique.

Nous pouvons donc séparer aisément l’acétone par précipitation. . à froid et doser ce corps en présence d’acide - -hydroxybutyrique et. réciproquement. Toutefois, après quinze minutes, il y a un peu d’acide B-hyd roxybutyrique attaqué, ce qui se manifeste par un accroissement de la quantité d’acétone précipitée à froid corrélative à une diminution. de l’acide B-hydroxybutyrique.

LT

Nous pensons que le temps de contact optimum pour la précipitation de l’acétone à l’état de complexe est de 5 minutes et c’est cette durée que nous emploierons lorsqu'il s'agira, dans une urine, de doser Pacide 6-hydroxybutyrique en présence d’acétone.

*20 Influence des proportions de réactifs. — Nous avons voulu nous rendre compte de la sensibilité de la réaction en faisant varier les quantités de chacune des deux solutions, acétonique et B-hydroxybutyrique, mises en œuvre. Nous avons obtenu des résultats satisfaisants dans l’ensemble (Tableau XXVITI) en dosant l’acétone après un temps de contact de 5 minutes. Il semblerait même que l’attaque de l’acide B-hydroxybutyrique par le réactif de NessLer se révèle plus complète lorsqu'elle a lieu en présence de traces d’acétone. Pour 17 cm8 5 de réactif mis en œuvre, il ne faut toutefois pas opérer sur moins de 1 mgr. d'acide 8-hydroxybutyrique — nous avons vu précédemment pourquoi—, ni sur plus de 3 à 4 mgrs d’acétone.

Tageau XX VIII

Action du réactif de Nessler sur des mélanges d’acétone et d'acide B-hydroxybutyrique en fonction de la quantité de chacun de ces corps respectifs. |

Hans aide Éyarosy | MBpnnmnt |

ao et Rp He es on | 1,209 2,08 1,208 2,145 2,418 2,08 D 20 2,115 8.627 RAT RP Re ae ED 2,097 1,209 4,16 * | 1,208 4,10

Action du réactif de Nessler sur l’acide acétylacétique. — Ayant montré que dans notre technique nous pouvions nous débarrasser de l’acétone, nous avons étudié l’influence de l’acide acétylacétique..

Nous avons donc recherché :

REA de

a) si cet acide précipitait à froid par le réactif de NESSLER,

b) si, dans un mélange des trois corps cétoniques, l’acide acétyl-

acétique précipitait à froid par le réactif de NESSLER en même temps que l’acétone, ou si, au contraire, la totalité ou une partie n’était précipitable qu’à chaud en même temps que l’acide 6-hydroxybutyrique.

Pour ces déterminations nous avons utilisé la solution d’acide acétylacétique libre préparée selon le processus indiqué note 1 au bas de la page 40.

Il ressort de nos premiers essais qu’une partie de l’acide acétylacétique précipite à froid par le réactif de NessLer durant les 5 minutes

de contact et que l’autre partie précipite à chaud. Le pourcentage

respectif de chacune de ces deux précipitations en fonction du temps de contact est exprimé dans le tableau XXIX en milligrammes d’acétone. Il montre qu’en prolongeant le temps de contact la proportion d'acide acétylacétique précipité à froid va en croissant.

TagzEeau XXIX

Pourcentage d'acide acétylacétique précipité à froid par le réactif de Nessler en fonction du temps de contact.

sé Milligram- .…. | Pourcen- Miligrar- EU Quantité d'acé- | mes d’acé- tage de tone préc. | tone préci-| Ph bi | l'acétone PRES :4| pités ensuite récipitée ra PE a à chaud . AU É froid 11 h. au bain-marie bouil- NAS NE OU . 5,17 5. à froid et 4h. au bain- * marie bDoutlan teste &,07 4,04 5,12 79,60 410” à froid et 4 h. au bainmarie bouillant.. TE A OURS k,44 0,76 5547 85,25 30/ "à froid et 4 h. au bainmarie bouillant......... &,73° 0,41 5,14 92,10

Nous avons enfin fait une série d’essais complets sur l'action à à chaud et à froid du réactif de NEssLER sur l'acide ‘acétylacétique en

75 em

présence d’acétone ou d’acide 8-hydroxybutyrique, ou de ces deux ‘corps réunis. Nous en avons conclu que, pour l’acide acétylacétique, selon que l’on opère en présence de ce seul acide, ou en présence de cet acide, d’acétone ou d’acide 8-hydroxybutyrique ou de ces deux corps réunis, les pourcentages de précipitation à froid, après un contact de 5 minutes, s’établissent comme suit :

Acide acétylacétique seul ................, 80 à-82 p, 100 Acide acétylacétique +acétone..........….... 88 p. 100 Acide acétylacétique+acétone—+acide 6-hy-

TOR VDLOMRIQUERS ER ENS eee one ee 90 p. 100

La précipitation à froid de l’acide acétylacétique par le réactif de NEssLer est donc accélérée en présence d’acétone et d’acide 8-hydroxybutyrique et nous pouvons admettre que dans un mélange -de ces deux corps, 80 à 90 p. 100 de l’acide acétylacétique se trouvent précipités après 5 minutes de contact à la température ordinaire. Nous ne pouvons songer à prolonger le temps de contact sans risquer de décomposer une partie de l’acide B-hydroxybutyrique.

Action du réactif de Nessler sur quelques acides existant .

dans l'urine normale. — Nous avons étudié un acide cétonique : Pacide pyruvique (CH$ — CO — COH?) et deux autres acidesalcools : l’acide lactique (CH$ — CHOH — CO?H) et l'acide citrique (CO2H — CH2— CO H — CH2— CO2H) qui sont tous trois des

Con

“constituants normaux de l’urine.

Les acides lactique et pyruvique prennent naissance dans les mus- -cles à partir du glucose. On les retrouve dans le sang et dans l'urine normale et pathologique, surtout après de grandes fatigues : l’acide lactique, après un travail musculaire violent, peut atteindre dans l'urine une concentration de 1 gr. 37 par litre [ TERROINE et Trim- BACH (59) |.

19 Acide pyruvique. — L’urine normale en renferme environ 300 milligrammes par litre mais ce taux augmente dans l’avitaminose BL :

Opérant sur une prise d'essai de 2 mgrs 70 nous avons obtenu.

après 4 heures de chauffe à 1000 avec du réactif de NESSLER un com-

plexe mercuriel correspondant à 0 mgr. 116 d’acétone et du mercure :

réduit nécessitant pour être oxydé 0 cm 18 d’iode N/10.

LME

Le complexe mercuriel précipité, repris par un acide,n’a pas fourni par distillation de substance réduisant l’hypoiodite, ce n’est donc pas un complexe acétone-sels de mercure.

Par le VAN SLYKE nous avons eu un précipité correspondant à 1 gr. 78 d’acide $-hydroxybutyrique par litre contre 26 mgrs avec la technique à l’iodomercurate.

2. Acide lactique. — Nous avons obtenu 0 mgr. 03 de complexe mercuriel exprimé en acétone,-et 0 cm3 40 d’iode N/10 a été nécessaire pour réoxyder le mercure réduit pour une prise d’essai de 2 mgrs 70°

Par contre il n’y a eu aucun précipité avec le Van SLYKE.

30 Acide citrique. — L’urine peut en renfermer jusqu'à 0 gr. 72 par litre, mais le taux d'élimination normal oscillerait entre 0 gr. 25 et. 0 gr. 68 par jour

Si, par la technique de Van SLYKkE, nous avons obtenu un précipité correspondant à 7 grs 67 d'acide B-hydroxybutyrique par litre, nos 2 mgrs 20 d'acide citrique n’ont par contre provoqué, par notre technique à l’iodomercurate alcalin, aucune formation de complexe se ” comportant comme celui de l’acétone, ce qui confirme les observations de MARQUE [ 46]. |

En conclusion, nous voyons que lorsque nous dosons dans l’urine, par le procédé classique de Van SLyKE ou par le nôtre, l’acide 8-hydroxybutyrique, nous dosons en même temps d’autres acides qui viennent de ce fait fausser nos dosages (1). Cette remarque s’appliqueplus particulièrement à la technique de VAN SLYKE.

(:) More (48) signale que Pallantoïne de l’urine réduit le réactif de- NEssLer à la température ordinaire.