I. — Calcification in vitro

Rogisox [75] et ses collaborateurs, ont fait depuis 1925 des expériences de calcification in vitro afin d'étudier particulièrement le rôle des esters phosphoriques dans lossification. Ils montrèrent sans l'expliquer l'importance de la matrice préosseuse dans la fixation du sel de los, ils ne donnèrent pas de résultats quantitatifs. Par ailleurs LOGAN et TAYLOR (45, 46, 47], plus récemment (1935, 1937, 1938), étudièrent la solubilité du sel de l’os in vitro. Ils ont apporté des résultats qui, bien que n’ayant pas directement trait à la formation de l’os in vitro, n’en ont pas moins pour nous un grand intérêt. Toutes ces expériences éclaircissent en effet progressivement certains points du problème posé.

« Le fait que les os des animaux rachitiques ne manquent pas de phosphatase me conduisit, dit ROBISON, à essayer si la calcification pouvait se faire en immergeant ces os in vbitro dans des solutions d’hexosemonophosphate de calcium ou d’autres esters phosphoriques hydrolysables >». ROBISON conduisit des expériences en collaboration avec Miss SOAMES et GOLDBLATT [31] puis avec la collaboration histologique de Miss FELL [20]. L’expérimentation était la suivante : des cartilages costaux ou des coupes d’épiphyses de tibias de Rats rachitiques étaient immergés durant 16 heures à 37° dans une solution d’hexosemonophosphate de calcium ou de glycérophosphate de calcium. L’os homologue plongé dans une solution de phosphate de sodium ou de chlorure de sodium servait de témoin, le milieu étant dans les deux cas saturé de chloroforme. On observait en général que la zone du cartilage hypertrophié se calcifiait, tandis que les petites cellules du cartilage épiphysaire ne présentaient aucun dépôt calcique. La calcification in vitro, se fait exactement où elle aurait eu lieu in vivo chez un animal normal. Mais, dans ce cas, les conditions sont tout à fait différentes de celles rencontrées dans l’organisme vivant ; la solution est très concentrée en calcium et ne contient pas de phosphates inorganiques tant

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que la phosphatase n’a pas hydrolysé l’ester phosphorique.

SHIPLEY [104] en 1924, puis en 1926, SHirLey, KRAMER et HOWLAND [104] immergèrent des os de Rats rachitiques, le premier dans du sérum de Rats normaux, le second dans une solution stérile de sels inorganiques (CINa, SO,Mg, CO;NaH) contenant les ions Ca” et POS en quantités identiques à celies existant dans le plasma, soit 18 mg. de calcium pour 100 cm et 4 mg. de phosphore pour 100 em. La calcification s’opère alors « normalement » en 9 heures environ. Ces auteurs concluent de l’examen histologique des coupes d’os que < dans l’ossification in vitro des os rachitiques comme dans le rachitisme humain, le premier fait que l’on observe est la formation d’une ligne de calcification dans le cartilage proliférant ; la calcification ne se manifeste pas uniformément dans une zone, mais dans de petites aires séparées les unes des autres, par du cartilage non calcifié qui s’ossifient progressivement... ». Il s’agit donc de la reproduction in vitro d’un processus physiologique. Par ailleurs le phosphate tricalcique se dépose dans une matrice intercellulaire de substance osseuse et non dans le cytoplasme cellulaire.

RoBisoN et SOAMES en 1928 et 1930, virent que la calcification s’effectuait à des concentrations en ions calcium et phosphoriques plus faibles en présence d’un ester phosphorique qu’en l’absence de celui-ci. Dans ce cas, le produit minimum [Ca] X [P] requis pour obtenir la précipitation est plus bas. 0,5 mg. P pour 100 cm’, sous la forme d’ester phosphorique (taux de cet ester dans le plasma) peuvent déterminer la précipitation de phosphate tricalcique quand le milieu contient Ca'*. Plus le taux des esters est élevé plus la précipitation augmente. Pendant l’expérience, il se produit une légère augmentation de la cencentration du phosphate inorganique dans le liquide où l’os est immergé, mais elle dépasse rarement 0,5 mg. pour 100 em* et n'apparaît que vers la fin de la période d'immersion.

Différents auteurs ont étudié l'influence de plusieurs facteurs sur la calcification in vitro. SHipLEY [104], Hozr [36] en 1927, KRAMER [36], SHELLING et ORENT, à la même époque, ont établi que le chlorure de sodium, le chlorure de potassium et le chlorure de magnésium sont des inhibiteurs de la calcification. Dans le cas où ces corps sont présents, la valeur du produit [Ca] x [P] requise pour obtenir la précipitation est

plus grande. L’acétone, l’alcool, le chloroforme ont peu ou pas d’effet sur la phosphatase. Le cyanure de potassium est faiblement inhibieur en présence d’ester, mais le formol l’est fortement. Cependant dans une solution de sels inorganiques une concentration M/1000 de cyanure de potassium arrête la calcification. Ce fait montre que l’activité des cellules vivantes est nécessaire dans le processus d’ossification. D’autre part, la dessication du cartilage ou le traitement par les solvants des corps gras réduit son aptitude à se calcifier, mais ne touche pas le mécanisme phosphatasique.

Mac LEOD et ROSENHEIM [78] ont étudié l’action du bicarbonate de sodium sur la calcification. Lorsque le taux de bicarbonate de sodium atteint 0,2 pour 100 cm*, c’est-à-dire une concentration voisine de celle trouvée dans le sang, la calcification se fait régulièrement avec [Ca] X [P] plus bas, que pour des concentrations de l’ordre de 0,03 pour 100 cm utilisées dans les premières expériences. Il faut en conclure qu’un complexe carbonatophosphaté précipite et que sa solubilité est moindre que celle de (PO,),Ca; qui se forme, en l’absence de bicarbonate. La précipitation séparée de carbonate de calcium paraît exclue, car aucun dépôt ne se fait en l'absence de phosphate, même avec de fortes concentrations de calcium.

Au point de vue du pH Ia calcification in vitro se fait entre pH = 6,5 et 8. Dans les solutions acides, les quantités de calcium et de phosphate utiles pour obtenir la précipitation sont plus grandes que dans les solutions alcalines, et les résultats les meilleurs sont obtenus pour des pH voisins de celui du plasma, soit à pH — 7,4-7,2.

ROSENHEIM et ROBISON [78] ont étudié l’action des protéines du sérum, du glucose, et d’autres constituants organiques du sang, sur la calcification in vitro. Si l’on ajoute 7 p. 100 de protéines du sérum à une solution saline, il faut pour obtenir alors une précipitation, augmenter les concentrations de phosphore et de calcium, car il se forme une combinaison protéine-calcium qui diminue la concentration des ions Ca‘ dans la solution. Le glucose donnerait ainsi une combinaison : calcium-glucose qui diminue le calcium ionisé et a de ce fait une action inhibitrice sur la calcification.

Miss FELL [20] du « Strangeways Research Laboratory » de Cambridge a montré qu’un fémur d’embryon de Poulet de

5 jours, cultivé in vitro dans une solution calcifiante, continue un remarquable développement normal, tant histologique qu’anatomique. De plus (FELL et RoBisoN 1929 [20]) au moment de la transplantation, les cartilages de cet os ne possèdent pas d’activité phosphatasique mesurable, mais après trois jours in vitro, cette activité enzymatique peut être mise en évidence et elle s’accroît progressivement. Ceci est observé seulement où des cellules hypertrophiques se forment dans des cartilages qui s’ossifient normalement. À la suite de ces expériences, RoBisoN [75] conclut : « Cette grande augmentation de dépôt de sels de calcium, et la délimitation nette de la zone de calcification des transplants après traitement par des solutions calcifiantes, semble indiquer que la capacité de poursuivre la calcification est une propriété spéciale associée à un stade défini du développement de la substance intra-cellulaire ».

On peut espérer mettre à profit la calcification des os in vitro pour préciser la nature de la combinaison phosphocalcique prenant naissance primitivement dans la minéralisation du squelette. D’après de nombreuses expériences le précipité qui se forme dans des mélanges salins in vitro semble être en première approximation (PO,),Ca; ; mais des variations de composition ont été observées en fonction de la composition de la solution à partir de laquelle il se constitue (KLEMENT, GASS- MANN). De plus lorsque le précipité demeure en contact avec le solvant, sa composition est altérée et le rapport : Ca/P augmente. Le précipité obtenu par l’union de POS et Ca* en solution légèrement acide peut être PO, CaH. Il se transforme lentement en (PO;):Cas. Si CO;NaH est présent dans la solution, on obtient un précipité de 3 (PO;)2Ca3. CO;Ca. La nature chimique du sel de‘l’os dépend de la marche de sa précipitation.

Le sel de l'os se forme-t-il par un mécanisme du même ordre, en une seule fois ou en plusieurs étapes ? Suivant cette seconde hypothèse, le précipité obtenu en premier lieu (soit (PO,):Caz) adsorberait par la suite des ions supplémentaires tels que : Ca“ et CO, de la phase liquide. La concentration des ions Ca‘ et POS nécessaire pour former le sel de l'os, dépend du processus de précipitation.

Locax et TayLor [45] ont cherché pour quelles concentrations en ions calcium et en ions phosphorique le sel de los

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précipite de la solution. Ils ont suivi les variations du produit de solubilité : [Ca“]# xX [PO;}?. Selon les quantités plus ou moins grandes de sel de l’os où de phosphate tricalcique, en équilibre in vitro avec une solution contenant les ions PO:,, CO; et Ca“. LoGaN et TayLoRr [45] sont arrivés à cette conclusion. Le produit ionique [Ca*‘}; x [PO]: augmente tandis que la quantité d’os, ou de précipité (PO,),Ca; en équilibre avec la phase liquide décroît au-dessous de 150 mg. par litre ». Si le sel de l’os consistait uniquement en des molécules formées par l’union simultanée des ions, le produit de solubilité du sel obtenu à partir des solutions sursaturées serait essentiellement le même, que peu ou beaucoup de phase solide se trouve en équilibre avec la phase liquide.

En général, les os des animaux jeunes ont une proportion de CO; à P plus petite que celle- existant dans les os adultes (HUGOUNENQ 1900). Cet enrichissement progressif en carbonate peut être dû à des changements très lents, analogues à ceux observés dans les précipités à long équilibre. LoGan et TAYLOR [45] ont remarqué que la composition de tels précipités dépend de la teneur de la phase liquide en ions Ca**' et en anions CO; et POS qui peuvent être adsorbés. Ces expériences montrent quelle est la complexité de l’étude du « sel de l’os » au point de vue de sa formation, de sa nature chimique et de son évolution. Mais ces données sont-elles applicables à la calcification rapide de coupes d’os ? Cela est probable en première approximation. Toutefois les processus de « remplacement » des ions POS et CO; ou CO. signalés par LoGaN rendent à coup sûr difficile lPinterprétation des faits observés.

Nous nous sommes proposés, en employant la méthode de calcification in vitro, d'essayer de voir quelles sont les quantités de phosphore et de calcium fixées par les cartilages de conjugaison et les os métaphysaires d'animaux normaux, et de faire le rapport des ions POS et Ca” enlevés à la solution par l'os.

Le « sel de l’os > pouvant être soit (PO;),Caz, soit PO;CaH, soit 3(PO,;)»Cas. CO;Ca, les rapports du phosphore au calcium dans ces différents sels, sont respectivement

HR — 0,46 pour 3 (PO,),Ca,. CO,Ca PF

a D'olpour (PO,), Cas

SEUA vas

4 0111poutr PO, Caï.

Ca

Notre premier but est de comparer les rapports expérimentaux observés à ces rapports théoriques et d’en déduire si les ions POS et Ca fixés le sont en quantité correspondant à la formation de l’un ou de l’autre sel.

Par ailleurs cette étude devait en outre permettre de mesurer l'affinité d'un fragment osseux pour les ions calcium et phosphorique au contact desquels il est placé. I en découle que si on la poursuit parallèlement sur des os normaux et sur des os rachitiques on doit pouvoir répondre à la question suivante : posée depuis 1910 par LEHNERDT : Le rachitisme est-il une maladie au cours de laquelle les os présentent une réduction d’aptitude à fixer les sels phosphocalciques ? C’est là un problème important à résoudre et jusqu'ici les travaux qui lui ont été consacrés sont d’ordre qualitatif. Le plus important d’entre eux a été poursuivi par ROSENHEIM [78]. Il a porté sur l’ossification in vitro, de cartilage de conjugaison, d’os de Rats rachitiques soumis depuis des temps plus ou moins longs au régime provoquant la dystrophie. La conclusion est : « l’aptitude du cartilage à se calcifier diminue au fur et à mesure que l’on prolonge la période de régime rachitigène ». Il est difficile de ne pas accepter le fait que des modifications dans le pouvoir calcifiant du cartilage peuvent jouer un rôle dans le rachitisme. Nous nous sommes efforcés de préciser l’importance de ce rôle.