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En titrant par l’acétate d’urane la solution de phosphate, j'ai reconnu qu'elle contenait, en chiffres ronds, 1 millig. 5 d'acide phosphorique par centimètre cube. De sorte que 6 milligrammes et 12 milligrammes d'acide phosphorique n’ont eu dans ces conditions aucune action.

Une proportion plus forte d'acide phosphorique se fait de nouveau sentir, comme on le voit dans la série suivante :

SULFATE ACIDE SOLUTION , : è phosphate EAU SULFOCYANATE | ÉPAISSEUR ferrique. |sulfurique.|{e potasse.

cent. cubes.|cent. cubes.

En Op

La solution de phosphate contenait 0 gr. 0054 de P°0° par

centimètre cube.

C'est-à-dire qu’à partir de 15 milligrammes d'acide phosphorique pour À milligramme de fer, la coloration baisse.

Des quantités cinq fois plus considérables d'acide phosphorique ne la font, d'ailleurs, pas baisser beaucoup plus, ainsi que je lai vu dans d'autres expériences qu'il est inutile de rapporter ici.

En résumé, nous avons vu que la coloration est proportionnelle au fer, moyennant qu'il y ait un excès d'acide sulfurique et une proportion constante de sulfocyanate ; nous avons vu que les sulfates minéraux n’ont pas d'action, et que l’acide phosphorique lui-même n’en a pas s’il ne dépasse pas un taux assez élevé.

Nous avons vu enfin, par les chiffres mêmes des expériences, que la quantité de 4 milligramme de fer, dans 25 centimètres cubes de solution avec 50 centigrammes de sulfocyanaie d’'ammoniaque, présente l'intensité colorante requise pour une bonne lecture colorimétrique.

Nous allons voir maintenant comment on peut le plus commodément réaliser ces conditions dans l’analyse des tissus el des sécrétions.

2 Application du dosage colorimétrique aux recherches physiologiques.

Examinons, comme exemple, une analyse de sang.

Il nous faut une quantité de fer voisine de 1 milligramme. D'après ce que nous savons, il faudra prendre, par conséquent, pour un dosage, environ 2 grammes de sang; ces 2 grammes de sang contiennent en chiffres ronds 2 milligrammes d'acide phosphorique; celui-ci ne

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peut donc nous troubler et nous pouvons opérer sur les cendres totales.

Etant donnée la petite quantité de matière organique à détruire, étant donnée aussi la quantité de fer, si petite que la moindre perte conduirait à des erreurs graves, J'ai imaginé le procédé de destruction suivant, qui m'a été inspiré par la méthode de A. Gautier pour la destruction du foie en vue du dosage de l’arsenic.

La matière à analyser est placée dans un ballon en verre ordinaire, de 80 à 100 centimètres cubes. Il n’est pas nécessaire qu'elle soit desséchée ni pulvérisée. On y ajoute 2 centimètres cubes d'acide sulfurique concentré exempt de fer, et on chaufle doucement sur un bec Bunsen, en tenant le ballon incliné pour éviter les projections. La matière organique, quelle qu’elle soit, se dissout dans l'acide sulfurique chaud. souvent avec une série de petites explosions, et forme bientôt un liquide goudronneux. Celui-ci ne tarde pas à foisonner, puis des gouttelettes jaillissent sur toute la surface interne du ballon, et finalement l’acide sulfurique se met à distiller du pôle inférieur au pôle supérieur de la sphère du ballon, redescendant le long des parois en filets brunâtres. Tout cela ressemble au procédé de combustion imaginé par Kjeldahl pour le dosage de l'azote. Mais, ici, sans attendre davantage, j'emploie comme oxydant l'acide azotique concentré. À cause de l’eau de la solution acide, on ne peut verser celle-ci dans l'acide sulfurique bouillant; on retire donc le ballon du feu, on laisse refroidir un peu, et on ajoute, en tenant toujours le ballon incliné, quelques gouttes d'acide azotique concentré, au moyen d'un flacon compte-gouttes. Si l'acide sulfurique est au degré de température convenable, l'acide azotique ne détermine aucune explosion, mais il se produit un foisonnement prolongé, avec dégagement de

vapeurs nitreuses. Si l'acide sulfurique était trop froid, la réaction ne se produirait pas bien et il faudrait alors réchauffer. Il y a là un tour de main qui s’acquiert avec la moindre expérience. On ajoute goutte à goutte l'acide nitrique tant que la réaction se produit, puis on replace le ballon sur le feu; généralement, la liqueur qui s'était éclaircie par l’action de l'acide nitrique jusqu’à la couleur rouge, brunit de nouveau; on recommence alors comme la première fois, puis une troisième, une quatrième fois sil le faut, jusqu’à ce que finalement la petite quantité de liqueur placée au fond du ballon ne présente plus qu'une teinte jaune-verdâtre très claire; chauffée jusqu'à l'ébullition, ou jusqu’à la température immédiatement inférieure, lorsque l'acide distille, sans bouillir, du bas au haut du ballon, cette liqueur ne doit plus changer de couleur. Par le refroidissement elle doit devenir complètement incolore.

La combustion est alors terminée. Si le fer est en quantité notable (1 milligramme ou davantage) on aperçoitune poudre cristalline plus ou moins abondante au fond de la goutte limpide et réfringente que forme l'acide sulfurique. Ce précipité contient dans ce cas la majeure partie du fer, comme je m'en suis assuré en le séparant par décantation du liquide surnageant.

On laisse refroidir puis on ajoute une vingtaine de centimètres cubes d’eau distillée, on agite pour bien mélanger et on porte à l’ébullition pendant quelques minutes. Cette opération vise un double but : 1° dissoudre le précipité dont je parlais plus haut; cette dissolution s’accomplit entièrement sans aucune peine; 2° chasser les dernières traces d'acide nitrique et de vapeurs nitreuses que l’ébullition de lacide sulfurique concentré ne chasse pas. Mais, après l’ébullition en présence de l’eau, ces traces ont dis-

paru, comme je m'en suis assuré à diverses reprises, notamment au moyen du sulfate de cinchonamine.

On à ainsi, sans avoir fait un épuisement ni une filtralion, dans le récipient même où l'on avait pesé la matière première, c'est-à-dire sans aucune chance de perte, une solution peu étendue, parfaitement limpide et incolore; le fer y est contenu à l’état de sulfate ferrique, en présence d'un grand excès d'acide sulfurique ; nous sommes d’emblée dans les conditions où doit s’effectuer le dosage colorimétrique. Il ne reste qu’à ajouter une quantité donnée de sulfocyanate, étendu à un volume donné, et porter au colorimètre pour faire la lecture.

Pratiquement, je procède de la façon suivante :

Le liquide est après refroidissement complet (détail important) versé dans une petite fiole dont le long col porte deux traits de jauge, l'inférieur à 20 centimètres cubes, le supérieur à 25 centimètres cubes. Le volume de ce liquide doit être sensiblement inférieur à 20 centimètres cubes. On rince le ballon avec un peu d’eau distillée qu'on reverse de même dans la fiole, et on complète le volume exactement à 20 centimètres cubes. Puis on verse jusqu’au deuxième trait de jauge une solution de sulfocyanate à 10 p. 100. On agite pour bien mélanger. Si la quantité de tissu employée était bien choisie pour donner la quantité de fer convenable, on a alors une liqueur d'un rouge intense, mais transparent, assez semblable à la coloration du vin de Bordeaux. On remplit à moitié de cette liqueur l'un des godets du colorimètre, l’autre contenant l’étalon du verre, et on établit l’égalité de teinte; il ne reste qu'à lire sur l’appareil l'épaisseur correspondante.

On possède d'autre part une solution titrée de sulfate ferrique, préparée en dissolvant 1 gramme de fil d’archal dans de l’eau acidulée par l’acide sulfurique (celui-ci en

excès), peroxydant par l'acide nitrique, dont on chasse l'excès par une ébullition prolongée, et complétant le vo- ‘Jume à 1 litre. De cette liqueur-mère, qui se conserve très bien, on prépare à mesure des besoins une solution à 1/20. Chaque fois que l'on a un dosage ou une série de dosages à faire (1), on titre son étalon de verre au moyen de cette liqueur vingtième. On en remplit la petite fiole jaugée à deux traits jusqu’au trait inférieur, on ajoute les 5 centimètres cubes de solution de sulfocyanate et on porte au colorimètre. L’épaisseur obtenue comme moyenne de plusieurs lectures est alors l'épaisseur 1 de la série. Le quotient de cette épaisseur par l'épaisseur observée dans chaque cas donne le poids en milligrammes du fer contenu dans le tissu mis en œuvre. |

Il ne faut pas tarder à faire la lecture après la réaction du sulfocyanate ; en effet, la coloration baisse peu à peu; cette diminution est très lente lorsqu'on est dans de bonnes conditions, c’est-à-dire, qu'on à environ { milligramme de fer dans 25 centimètres cubes; elle est plus rapide pour les colorations moins intenses.

Dans le premier cas, elle est imperceptible après un quart d'heure ou même une demi-heure; pour le second cas, voici un exemple :

Lectiremaite RP ANeure Re TR UE — CR AU TR CROQUER ES MN nl EEE — à 0 NOT APN EN EME TANT

(1) I ne serait pas prudent de déterminer une fois pour toutes cette valeur e de l’étalon colorimétrique ; on retombe presque toujours sur la mème valeur de e, mais en refaisant ce titrage en tête de chaque série de dosages, ce qui fait perdre moins de cinq minutes, on se met à l'abri des causes suivantes d'erreur possible : 10 déplacement de la source lumineuse par rapport au colorimètre ou déplacement du miroir de celui-ci (les erreurs provenant de ce chef pourraient être énormes); 2 changement de titre de la solution sulfocyanique; 39 variation de la température assez forte pour influencer la réaction colorée.

ie —

On voit que dans le cas de l'exemple, que j'ai choisi exprès avec une leneur en fer très faible, et telle qu'on doit toujours chercher à l'éviter, pour les raisons que nous avons vues plus haut, la vitesse de la décoloration est encore assez faible pour qu'on ait le temps de faire sa lecture sans erreur de ce chef.

Il est nécessaire que la liqueur résultant de la combustion soit complètement décolorée; or, il est difficile d'obtenir ce résultat avec 2 centimètres cubes d'acide sulfurique si on à à détruire 4 ou 5 grammes de tissu frais (au lieu de 2 grammes de sang que nous supposions); dans ce cas, la meilleure manœuvre consiste à prendre 4 ou 5 centimètres cubes d'acide sulfurique au début de l'opération ; puis, quand elle est terminée, on incline le ballon sur un support de facon qu'il ait le col un peu déclive, et on contüinue à chauffer à la température voisine de l’ébullition ; l'acide sulfurique distille alors goutte à goutte au dehors, on le recueille dans un verre de Bohême, et on pousse cette distillation jusqu'à ce qu’il ne reste plus que 2 centimètres cubes environ dans le ballon. Si, en effet, on garde plus de 2 centimètres cubes d'acide sulfurique dans les 20 centimètres cubes de liqueur auxquels on ajoute le sulfocyanate, il se forme peu à peu de l’acide persulfocyanique qui se précipite en jaune, et trouble la lecture.

Telle est la marche de l'opération; elle est, on le voit, simple et rapide. Il faut moins d’une heure pour la mener à bout; elle est plus longue à expliquer qu'à exécuter.

D'autre part, les manipulations nécessaires pour détruire la matière organique et obtenir la liqueur que l’on soumet au colorimètre, ne laissent guère de place pour une erreur mème entre des mains peu exercées, pourvu que l’on ÿ apporte quelque attention. La prise d'essai peut être déterminée avec toute la précision que l’on souhaite. S'il s’agit

d’un tissu cohérent, foie, rate, etc., la pesée ne présente aucune difficulté; pour le sang, rien n’est plus simple que de le faire couler directement du vaisseau dans le ballon même où se fera la combustion, après avoir taré celui-ci; de la sorte, la coagulation ne présente aucun inconvénient.

Quant à la colorimétrie elle-mème, nous l'avons suflisamment examinée. Il n’est donc pas téméraire de faire un dosage sur une quantité totale aussi faible.

On peut même, quand les circonstances l’exigent, opérer sur une quantité de moitié plus faible, et conserver la même précision. On n'a, en effet, qu’à étendre la liqueur à un volume total de 10 ou 12 centimètres cubes, par exemple; cela suflit amplement à remplir le godet du colorimètre. Il suffit de faire la colorimétrie de la liqueur titrée dans les mêmes conditions, en prenant le demi-milligramme ou même moins comme unité.

Dosage dans le cas d'un grand excès de cendres et particulièrement de phosphates.

Mais on ne peut plus opérer d’une façon aussi simple, et partant, aussi sûre, lorsqu'on a affaire à un tissu ou à une sécrétion qui contient extrèmement peu de fer, par exemple, la bile ou l'urine. |

Il est nécessaire, en effet, de séparer le fer de l'excès de résidus et particulièrement des phosphates qui viendraient fausser la réaction. D'autre part, lacombustion dans l'acide sulfurique, étantdonnée la quantité de matière relativement grande à détruire, n’est plus d’une application commode,

Quand j'ai voulu doser le fer de l’urine, voici comment j'ai procédé.

Une quantité assez grande d'urine, 200 ou 300 centi-

mètres cubes (j'ai quelquefois été jusqu’à 500) est évaporée dans une capsule de porcelaine, puis, quand elle est suffisamment concentrée, versée dans une capsule plus petite, additionnée d’un peu d'acide azotique et évaporée à siccité. On peut alors facilement effectuer l'incinération complète simplement sur le bec Bunsen, en chauffant modérément, le nitrate durée qui s’est formé aidant beaucoup la destruction de la matière organique ; en ajoutant encore un peu d'acide azotique après avoir laissé refroidir etchauffant de nouveau, on obtient des cendres blanches.

Ces cendres sont reprises par l’eau acidifiée par l'acide sulfurique, ou mieux l’acide chlorhydrique ; on verse dans un verre de Bohème, on ajoute un excès d'ammoniaque, puis on neutralise par l’acide acétique. On ajoute alors une quantité suffisante de la solution acétique d’acétate de soude telle qu’on l’emploie usuellement pour le dosage volumétrique du phosphate dans l’urine, et on met digérer au bain-marie. Le phosphate de fer se précipite sous forme de flocons jaunâtres qui se recueillent facilement sur un petit filtre Berzélius. Dès que toute la liqueur a passé par le filtre, on introduit celui-ci tout entier dans un petit ballon en verre dur, on y ajoute 3 ou 4 centimètres cubes d'acide sulfurique qui le dissolvent presque aussitôt, et on détruit totalement la matière organique par la chaleur et l'acide azotique.

On est ramené dès lors au cas précédent.

Jai voulu savoir si la précipitation du fer, en si petite quantité, était bien complète, ou bien s’il n'y avait point dans le procédé suivi pour l’incinération quelque cause d'erreurs.

J'ai fait les expériences de contrôle suivantes :

1° 25 centimètres cubes d’une solution de phosphate de potasse, contenant 0gr,0054 de Ph*0° par centimètre cube,

ont été additionnés de 20 centimètres cubes d’une solution de sulfate ferrique titrée, contenant exactement, pour ce volume, { milligramme de fer; la précipitation, la filtratration et la destruction du filtre ayant été effectuées comme il est dit plus haut, j'ai retrouvé, par dosage colorimétrique, ‘026,96.

Une deuxième opération, faite en ajoutant à la même quantité de liqueur ferrique 5 centimètres cubes d'une solution de phosphate de potasse à Ogr,054 de Ph°0° par centimètre cube, a fait retrouver 0,98 de fer.

La perle, dans ces conditions, est insignifiante.

2° Dans une des liqueurs filtrées, contenant des cendres d'urine d'où je n’avais pu retirer que des traces de fer, j'ai ajouté 4 milligramme de fer à l’état de sulfate ferrique. Après précipitation, la colorimétrie a indiqué dans le précipité la présence de 0,94 de fer.

3° Dans 300 centimètres cubes d’une urine, dont une autre proportion de mème volume n'avait fourni que des traces de fer, j'ajoute 15,25 de fer. L'analyse en donne 4%€,08, soit 87 p. 100 de la quantité mise.

Dans 250 centimètres cubes d’une autre urine, qui ne contenait toujours que des traces de fer, j'ajoute 07#,50 de fer. L’analyse en donne 05,46, soit 92 p. 100 de la quantité mise.

Il ÿ a donc perte d’un peu de fer dans la série des opérations; cette perte est voisine de 1 dixième de milligramme.

Il est à peine besoin d'ajouter que j'ai éloigné de l'endroit où Je fais l’évaporation et la combustion tout ce qui pourrait abandonner des particules ferrugineuses : tous les objets employés, supports, brûleurs, pince, etc., sont en cuivre ; les clous qui n'étaient pas indispensables ont été arrachés; ceux qu'il à fallu laisser, les crampons, par

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exemple, qui fixent au mur les conduites de gaz, ont été recouverts d'une épaisse couche de peinture. Ces précautions, qui ne sont pas indispensables dans le cas où toute l'opération est faite en peu de temps dans un ballon, prennent une importance considérable quand on a des évaporations qui durent longtemps dans une capsule découverte.-Il est toujours difficile, dans ce cas, de se protéger absolument contre les poussières ferrugineuses. Buxcr emploie dans ce but un grand carreau de vitre qui forme toit au-dessus du bain-marie.

Exemples d'analyses colorimétriques.

Ce que j'appelle ici rapport colorimétrique comprend les deux données expérimentales qui sont la base du calcul; on à en numérateur l'épaisseur sous laquelle la liqueur titrée présente la nuance de l’étalon; en dénominateur, l'épaisseur sous laquelle il faut prendre, dans les mêmes conditions, la solution sulfurique des cendres du tissu analysé porr obtenir cette même nuance. Le quotient donne, en milligrammes, la quantité de fer y contenue.

Foie de chien adulte. — Chien âgé d'environ trois ans, d'après l’état de la denture. Poids, 8 kilogrammes.

Tué par hémorragie. Aussitôt, l'abdomen est ouvert, une canule est introduite dans la veine porte, c! l’on fait passer par le foie environ 8 litres d’une soluf ‘n de sel marin à 7,5 pour mille.

Le foie, égoutté, pèse 278 grammes. Deux fragments